עבור חולות שאובחנו עם גידולים מוצקים של השד או הלבלב, יש מתאם חזק בין אירועי התקדמות המחלה, כמו גרורות או עמידות לטיפול, לבין תוצאות גרועות. המנגנונים המולקולריים התאיים השולטים בהומאוסטזיס ופיברוזיס של רקמות ידועים גם כשולטים בהתקדמות גידול מוצק. המעבדה שלי מעוניינת להבין את המנגנונים האלה כדי שנוכל לפתח טוב יותר טיפולים ואמצעי אבחון שיסייעו למטופלים.
אחד האתגרים הניסויים העיקריים הוא שיש צורך קריטי במודלים תלת מימדיים של סרטן שיכולים ללכוד אינטראקציות בין-תאיות במהלך תהליכים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים, ואז על ידי הבנת האינטראקציות הללו, ניתן להבין תובנות נוספות לגבי המחלות ואז לפתח אסטרטגיות טיפול חדשות. הפרוטוקול שלנו יספק שיטת תרבית תאים תלת מימדית חסכונית וניתנת לשחזור המשכפלת תכונות מיקרו-סביבה של רקמות in vivo. הפרוטוקול שלנו יספק שיטות תרבית תאים תלת מימדיות קלות ומהירות ללא פיגומים ומבוססות פיגומים בהן נוכל לכמת אינטראקציות תאיות הטרוגניות.
גילינו דרך לנסח ביעילות תרביות כדוריות תלת-ממדיות שניתן להשתמש בהן עם מודלים נטולי פיגומים, אך גם ניתן למזג אותן עם מערכות מבוססות פיגומים כדי למדוד פלישה והתנהגות של תאים. כדי להתחיל, הפעל את האור האולטרה סגול כדי לחטא את פנים ארון הבטיחות הביולוגית למשך 15 דקות. פתח את אבנט חלון ארון הבטיחות הביולוגית כדי לייצב את זרימת האוויר והפעל את מערכת שאיבת הוואקום.
נקה את משטח מכסה המנוע הפנימי ואת הצינורות של מערכת שאיבת הוואקום עם 70% אתנול. מחממים את מדיום תרבית התאים, PBS, ו-0.25% טריפסין EDTA ל-37 מעלות צלזיוס באמבט חרוזים. כעת, בחנו את התאים תחת מיקרוסקופ כדי לאשר מפגש של 70 עד 80%.
בעזרת שואב ואקום, שואבים וזורקים את מדיום התרבות מהתאים המצופים. שוטפים את המדיום הנותר פעם אחת עם שני מיליליטר PBS, ואז שואפים וזורקים את ה- PBS לאחר הכביסה. לאחר מכן, בעזרת מיקרופיפטה, הוסיפו מיליליטר אחד של טריפסין לצלחת תרבית התאים והניחו את הצלחת בתוך אינקובטור פחמן דו חמצני של 5% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.
כעת, הוסף מיליליטר אחד של מעכב טריפסין פולי סויה ב-PBS לצלחת כדי לנטרל את הטריפסין. כדי לפזר את אשכולות התאים, פיפטה את התערובת הנוזלית באמצעות מיקרו-פיפטה P-1000. אוספים את מתלה התאים מתחתית הצלחת ומעבירים אותו לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.
צנטריפוגה את הצינור ב-100 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר והשליכו את הסופרנטנט באמצעות שואב הוואקום. תן לבדיקות הפלואורסצנטיות המולקולריות להתחמם לטמפרטורת החדר למשך 15 דקות באמבט חרוזים ממוזג ב-37 מעלות צלזיוס. בעזרת מיקרופיפטה, השעו מחדש את התאים בשני מיליליטר של פתרונות מדיית הצבע של מעקב אחר תאי העבודה המתאימים.
דגרו את הצינורות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני. לאחר 30 דקות של דגירה, צנטריפוגה את הצינורות בחום של 100 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השתמש בשואב ואקום כדי לשאוף ולזרוק את הסופרנטנט.
השעו מחדש את הגלולה ביסודיות במיליליטר אחד של 10% DMEM המכיל FBS באמצעות מיקרופיפטה. כעת, אספו 10 מיקרוליטרים מתרחיף התא והעבירו אותו למיקרו-צינור המכיל נפח שווה של טריפאן כחול. לאחר ערבוב התאים, הוסף 20 מיקרוליטר מתמיסת הטריפן של התא לשקופית תא ספירת תאים.
הכנס את השקופית למונה תאים אוטומטי כדי לקבוע את מספר התא. חשב את מספר התאים החיים הממוצע הכולל משתי קריאות. הכן מלאי תאים עובדים לכל סוג תא בריכוז של 6.67 כפול 10 בחזקת שלושה תאים למיליליטר, שווה ערך ל-2,000 תאים ל-300 מיקרוליטר.
בעזרת מיקרופיפטה, העבירו את הנפח הנדרש לשלושה שכפולים טכניים ועוד אחד נוסף למיקרו-צינור. לאחר ערבוב יסודי עם פיפטה, העבירו 300 מיקרוליטר מהדגימה לבאר של תחתית בצורת U עם חיבור נמוך במיוחד של 96 בארות. מניחים את צלחת 96 הבארות בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
דמיין צמיחה ומורפולוגיה של כדור כל 24 שעות, עד 96 שעות, באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. הפעל את מכשירי ההדמיה והחממה האוטומטית. צור פרוטוקול הדמיה חדש במנהל המשימות של תוכנת ההדמיה כדי ללכוד את הצמיחה של 48 שעות של ספרואידים BT-474 בתרבית משותפת עם פיברובלסטים BJ-5ta ותאי אנדותל EA.hy926 שנצבעו בצבע עוקב התאים בכחול, כתום ואדום עמוק בהתאמה.
מלאו דלי קרח בקרח כדי לשמור על תמיסת תמצית קרום המרתף קרה והניחו את התמיסה על קרח. בעזרת פיפטה רב ערוצית, שאפו כ -170 מיקרוליטר מדיום מכלי התרבות. השג זכוכית מגדלת וקופסת אור מיני כדי להתבונן מקרוב בכדורים הקטנים.
הנח את צלחת הכדור בעלת 96 הבארות מעל קופסת האור ומקם את זכוכית המגדלת מעל. הגדר פיפטה P-200 ל -30 מיקרוליטר ואסוף את תמצית קרום הבסיס ליצירת שלוש מיקרו-טיפות. ודא שהצלחת בעלת 96 הבארות שטוחה ומקם את הפיפטה אנכית מעל הכדור.
כעת, שחרר את הטיפה מבלי לגעת בקרקעית הבאר. מניחים את הצלחת בחממה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר הדגירה, יש לכסות את הספרואידים ב-50 מיקרוליטר נוספים של תמיסת תמצית קרום המרתף לבאר ולדגור את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
לאחר מכן, בעזרת מיקרופיפטה, הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים לכל באר. 72 שעות לאחר הציפוי, תאי MCF-10A, MCF-10Ca1H ו-BT-474 שגודלו בתרבית משותפת עם EA.hy926 ו-THP-1 או עם BJ5-ta ו-THP-1 הראו עלייה משמעותית בשטח הספרואידים בהשוואה לספרואידים אפיתליאליים מונוקולטורים. לעומת זאת, תאי MDA-MB-468 בתרבית משותפת הראו ירידה משמעותית בשטח הספרואיד בהשוואה למונוקולטורה.
היישום של צבע מעקב תאים על תאי אפיתל גידוליים BT-474 ותאי סטרומה לפני התבססות הספרואידים הראה שתאי סטרומל, כולל EA.hy926 ו-BJ-5ta, יצרו את המבנים הניצנים בהיקף הספרואידים המרכזיים של BT-474. 24 שעות לאחר הציפוי, קרום הבסיס הונח על תאי אפיתל גידוליים BT-474 שגודלו בתרבית משותפת עם תאי סטרומל, מה שמדגים היווצרות מבנים פולשניים.
