Isolamento degli epatociti primari di ratto con controllo della perfusione multiparametrica

Riepilogo

Questo protocollo descrive l'uso di uno speciale catetere endovenoso, tubi monouso sterili standardizzati, controllo della temperatura integrato da monitoraggio in tempo reale e un sistema di allarme per la procedura di perfusione della collagenasi in due fasi per migliorare la coerenza nella vitalità, nella resa e nella funzionalità degli epatociti primari isolati di ratto.

Abstract

Gli epatociti primari sono ampiamente utilizzati nella ricerca di base sulle malattie del fegato e per i test di tossicità in vitro. La procedura di perfusione della collagenasi in due fasi per l'isolamento primario degli epatociti è tecnicamente impegnativa, specialmente nella cannulazione della vena porta. La procedura è anche soggetta a contaminazione occasionale e variazioni nelle condizioni di perfusione a causa di difficoltà nell'assemblaggio, nell'ottimizzazione o nella manutenzione della configurazione della perfusione. Qui, viene presentato un protocollo dettagliato per una migliore procedura di perfusione di collagenasi in due fasi con controllo della perfusione multiparametrica. Gli epatociti primari di ratto sono stati isolati con successo e in modo affidabile adottando le necessarie precauzioni tecniche nelle fasi critiche della procedura e riducendo la difficoltà operativa e mitigando la variabilità dei parametri di perfusione attraverso l'adozione di uno speciale catetere endovenoso, tubi monouso sterili standardizzati, controllo della temperatura e sistema di monitoraggio e allarme in tempo reale. Gli epatociti primari isolati di ratto mostrano costantemente un'elevata vitalità cellulare (85%-95%), resa (2-5 x 10⁸ cellule per 200-300 g di ratto) e funzionalità (albumina, urea e attività del CYP). La procedura è stata completata da un sistema di perfusione integrato, che è abbastanza compatto da essere installato nella cappa a flusso laminare per garantire il funzionamento asettico.

Introduzione

Gli epatociti primari sono strumenti importanti per la ricerca di base correlata al fegato, il trattamento delle malattie e l'applicazione come i test antidroga. L'attuale gold standard per l'isolamento primario degli epatociti è la procedura di perfusione della collagenasi in due fasi ^1,2,3 introdotta da Seglen nel 1970 4. Tuttavia, questa procedura è tecnicamente impegnativa e ha un alto tasso di fallimento se eseguita da chirurghi alle prime armi. Anche quando una perfusione è considerata di successo, si possono osservare drastiche differenze nella ....

Protocollo

Tutte le procedure e la stabulazione degli animali sono state eseguite con i numeri di protocollo R15-0027 e R19-0669 in conformità con i requisiti del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università Nazionale di Singapore.

1. Preparazione di soluzioni e strumenti chirurgici

1. Preparare tamponi e terreni di coltura cellulare nella Tabella 1 utilizzando acqua ultrapura.
2. Preriscaldare il tampone privo di calcio e il tampone di collagenasi a 37 °C a bagnomaria prima dell'uso.
3. Autoclave i seguenti strumenti chirurgici e attrezzature di laboratorio: un paio di forbici ....

Risultati

Un chirurgo potrebbe dire se la perfusione epatica sta procedendo senza intoppi osservando il risultato dopo determinati passaggi. Il primo risultato può essere osservato al momento della cannulazione, del taglio dell'IVC infraepatico e del ripristino della portata di perfusione. Il fegato dovrebbe aver cambiato completamente colore dal rosso scuro al marrone, pur mantenendo il suo volume. Se il fegato sembra leggermente sgonfio e ha una tinta rossastra o macchie di rosso, significa che la portata di perfusione è stata.......

Discussione

Ci sono alcuni punti che sono particolarmente importanti da osservare per la procedura di perfusione della collagenasi in due fasi in generale. In primo luogo, è necessario prestare particolare attenzione quando si reseca il fegato. Assicurarsi che il tratto gastrointestinale non sia danneggiato in quanto la perdita del contenuto comporterà la contaminazione batterica. Inoltre, evitare di danneggiare la capsula di Glisson, che copre la superficie del fegato durante la procedura animale. Se la lacrima è abbastanza gran.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material/Equipment
1 mL syringe	Nipro
27G needle	Nipro
Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture	Look	SP117
Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip	Bochem	10333511
Disposable Perfusion Set	Vasinfuse	BPF-112
Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack	Sigma-Aldrich	R3133
German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1×2 teeth , 14.5cm	Walentech
Greiner Cellstar aspirating pipette	Merck	GN710183
Haemocytometer
Integrated Perfusion System	Vasinfuse	IPS-001
Iris Scissors curved, stainless, 11cm	Optimal Medical Products Pte Ltd	CVD
Light microscope with 10X lens	Olympus
Mesh Sheet 100µM Nylon	Spectra-Teknic(s) Pte Ltd	06630-75
Operating Scissors, BL/BL, 13cm	Optimal Medical Products Pte Ltd	STR – BL/BL
Operating Scissors, SH/BL, 13cm	Optimal Medical Products Pte Ltd	STR – SH/BL
Reverse force hemostatic clip	Shanghai Jin Zhong Pte Ltd	XEC230
Water bath	Grant
Reagents/Chemicals
10X Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9056
CaCl2·2H2O	Merck	137101
Collagenase Type IV	Gibco	17104019
Dexamethasone	TCI	D1961
DMEM	Gibco	31600-034
Glutamax	Gibco	35050061
HEPES	Invitrogen	11344-041
Insulin	Sigma-Aldrich	1-9278
KCl	VWR	VWRC26764.298
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379
Linoleic acid	Sigma-Aldrich	L9530
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S8875
NaOH	Merck	106462
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Type I bovine collagen	Advanced BioMatrix	5005-100ml
William’s E Media	Sigma-Aldrich	W1878