다중 파라미터 관류 조절을 통한 원발성 쥐 간세포의 분리

요약

이 프로토콜은 특수 정맥 내 카테터, 표준화 된 멸균 일회용 튜브, 실시간 모니터링으로 보완 된 온도 제어 및 분리 된 일차 쥐 간세포의 생존력, 수율 및 기능의 일관성을 향상시키기 위해 두 단계 콜라게나제 관류 절차를위한 경보 시스템의 사용을 자세히 설명합니다.

초록

원발성 간세포는 간 질환에 대한 기본 연구 및 시험관 내 독성 테스트에 널리 사용됩니다. 원발성 간세포 분리를 위한 두 단계 콜라게나제 관류 절차는 특히 문맥 정맥 절제술에서 기술적으로 도전적이다. 이 절차는 또한 관류 설정의 조립, 최적화 또는 유지 보수의 어려움으로 인해 때때로 오염되고 관류 조건의 변동이 발생하기 쉽습니다. 여기에서, 다중 파라미터 관류 조절을 통한 개선된 두 단계 콜라게나제 관류 절차를 위한 상세한 프로토콜이 제시된다. 일차 쥐 간세포는 절차의 중요한 단계에서 필요한 기술적 예방 조치를 취하고, 특수 정맥 카테터, 표준화 된 멸균 일회용 튜브, 온도 제어 및 실시간 모니터링 및 경보 시스템의 채택을 통해 운영 어려움을 줄이고 관류 매개 변수의 변동성을 완화함으로써 성공적이고 안정적으로 분리되었습니다. 단리된 일차 래트 간세포는 지속적으로 높은 세포 생존율 (85%-95%), 수율 (래트 200-300 g 당 2-5 x 10⁸ 세포) 및 기능성 (알부민, 우레아 및 CYP 활성)을 나타낸다. 이 절차는 무균 작동을 보장하기 위해 층류 후드에 설치하기에 충분히 컴팩트 한 통합 관류 시스템으로 보완되었습니다.

서문

원발성 간세포는 간 관련 기초 연구, 질병 치료 및 약물 검사와 같은 적용을위한 중요한 도구입니다. 일차 간세포 분리를 위한 현재의 황금 표준은 1970년대 Seglen이 도입한 2단계 콜라게나제 관류 절차 ^{1,2,3입니다 4}. 그러나이 절차는 기술적으로 도전적이며 초보 외과 의사가 수행 할 때 높은 실패율을 보입니다. 관류가 성공적인 것으로 간주되는 경우에도, 간세포 생존력 (전형적으로 60%-95%)과 수율 (200-300 g 래트 당 0.5-5 x 10⁸)의 급격한 차이가 단리들 사이에서 관찰될 수 있다. 이는 다운스트림 실험의 품질과 규모에 영향을 미칩니다. 기술적 절차 외에도 상업적으로 이용 가능하거나 맞춤 제작 된 격리에 사용되는 관류 설정이 기여하는 요소입니다. 관류 설정의 조립, 최적화 및 유지 보수에주의를 기울여야합니다. 이 프로토콜의 목적은 두 단계 콜라게나제 관류 절차의 기술 절차 및 관류 설정의 다중 파라미터 관류 조절을 통해 일차 쥐 간세포의 단리의 성공률 및 안정성을 향상시키는 것이다.

기술적 측면에서 절차에서 가장 어려운 단계는 포털 정맥 통조림입니다. 다른 단계에 관해서는, 좋은 관행이 관찰되고 일반적인 예방 조치가 취해지면 격리의 안정성이 향상 될 수 있습니다. 따라서 외과 의사가 절차 중에 발생할 수있는 다양한 변수에 반응 할 수 있도록 각 단계에 대한 추론을 이해하는 것이 중요합니다.

래트 및 마우스로부터 간세포 및 간 비실질 세포를 단리하기 위한 다양한 프로토콜^이 1,2,5,6,7,8,9 발표되었다. 이러한 프로토콜에 사용된 관류 설정은 관류 튜브의 재사용, 온도 제어 문제, 관류 파라미터의 일상적인 최적화 필요성 및/또는 포털 정맥 캐뉼레이션을 위한 부적합한 유형의 정맥내(IV) 카테터 사용 등 몇 가지 단점을 가지고 있었다. 관류 튜브를 재사용하면 특히 튜브를 제대로 청소하고 소독하지 않은 경우 오염 가능성이 높아집니다. 일상적인 교체없이 튜브를 재사용하면 관류 설정이 누출 된 튜브 또는 커넥터, 막힌 버블 트랩 및 수축 된 튜브와 같은 문제에 노출되며,이 모든 것이 퍼퓨 레이트 압력과 유량을 크게 감소시켜 간 소화 효율에 영향을 미칩니다. 온도 조절을 위한 일부 설정에서 일정한 열원이 없으면 미리 예열된 버퍼는 시간이 지남에 따라 냉각되어 콜라게나제 활성과 소화가 낮아집니다. 다른 설정은 버퍼를 따뜻하게하기 위해 물 순환기에 연결된 재킷 유리 콘덴서를 사용하지만 부피가 커서 조심스럽게 청소해야합니다. 카테터를 빠져나가는 버퍼의 온도, 압력 및 유량은 안정적인 관류 상태를 보장하기 위해 격리 시작 전에 측정되고 최적화되어야 합니다. 최적화 후에도 매개 변수는 작업자의 작업으로 인해 격리 중에 중간에 변경 될 수 있으므로 차선책의 관류 및 소화로 이어질 수 있습니다. IV 카테터의 대부분의 유형은 통조림 동안 지속적인 관류를 허용하지 않기 때문에 문맥 정맥 캐뉼레이션에 적합하지 않습니다. 그들은 통조림이 성공적 일 때 외과 의사에게 즉시 알릴 수 없습니다. 또한, 포털 정맥을 변형시키지 않고 부드러운 카테터에 고정시키는 것은 어렵습니다.

여기에서는 표준화 된 일회용 멸균 튜브, 정확하고 안정적인 온도 제어를위한 실리콘 히터 재킷, 데이터 저장 및 관리가있는 실시간 모니터링 및 경보 시스템 및 특수 IV 카테터 사용을 사용하여 이러한 문제를 해결합니다.이 카테터는 캐뉼레이션 중에 포털 정맥을 뚫는 동안 지속적인 관류를 허용합니다. 우리가 아는 한, 우리는 이러한 모든 기능을 컴팩트 한 통합 관류 시스템 (IPS)에 결합 한 최초의 그룹으로, 휴대성이 뛰어나고 무균 작동을 보장하기 위해 층류 후드에 장착 할 수 있습니다.

프로토콜

모든 절차와 동물 주택은 싱가포르 국립 대학의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 요구 사항에 따라 프로토콜 번호 R15-0027 및 R19-0669로 수행되었습니다.

1. 용액 및 수술기구의 제조

1. 초순수를 사용하여 표 1 의 완충액 및 세포 배양 배지를 준비한다.
2. 칼슘이 없는 완충액 및 콜라게나제 완충액을 사용 전에 수조에서 37°C로 미리 예온한다.
3. 다음과 같은 수술 도구 및 실험실 장비를 오토클레이브하십시오 : 한 쌍의 날카로운 무딘 외과 가위, 한 쌍의 무딘 외과 가위, 한 쌍의 곡선 수술 가위, 두 쌍의 치아 조직 포셉, 두 쌍의 곡선 포셉, 두 개의 정맥 클립, 5cm 길이의 3-0 실크 수술 봉합사, 100 μm 나일론 메쉬 필터, 400 mL 비이커, 및 스테이지 (플로팅 마이크로 원심 분리기 튜브 랙).

2. IPS 설정( 그림 1 참조)

1. 층류 후드를 70% 에탄올로 닦아냅니다. IPS를 70% 에탄올로 닦아내고 층류 후드로 옮깁니다. 후드를 켜기 전에 >15 분 동안 UV로 살균하십시오.
   주의: 자외선에 노출되면 눈과 피부 화상을 입을 수 있습니다. 자외선을 켤 때 새시가 완전히 닫혀 있는지 확인하십시오.
2. IPS에 새로운 일회용 튜브 세트를 조립하십시오. 연동 펌프의 하류에 튜브를 실리콘 히터 재킷으로 감쌉니다. 실리콘 히터 재킷의 튜브 다운스트림에 관류 모니터를 조립합니다.
3. 두 튜브 입구의 롤러 클램프가 완전히 느슨해 졌는지 확인하십시오. 각 튜브 입구를 멸균 2mL 흡인 피펫의 테이퍼 끝에 연결합니다. 흡인 피펫 (입구)과 IV 카테터 (출구)를 칼슘이없는 완충액이있는 1 L 병에 두어 후속 프라이밍 단계 동안 완충액을 재순환시킬 수 있도록하십시오.

그림 2: 자체 테스트 인터페이스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. IPS를 켭니다. 터치 스크린 제어판에서 다음 작업을 수행합니다. 소프트웨어는 시작될 때마다 포괄적 인 자체 테스트를 수행합니다.
   주의: IPS는 외부 전원에 연결된 전기 장비입니다. IPS 또는 전원 케이블에 액체가 유출되면 전기적 위험이 발생할 수 있습니다.
   1. 자체 테스트 상태가 화면에 표시되는지 확인합니다(그림 2). 자체 테스트를 통과 한 구성 요소는 녹색으로 표시됩니다. 실패한 사람들은 빨간색으로 표시됩니다. 수정 후 테스트 아이콘을 탭하여 자체 테스트를 다시 반복하거나 시스템 입력 아이콘을 탭하여 작업 인터페이스에 직접 들어갑니다.
   2. 화면의 아무 곳이나 탭하여 작업 인터페이스에 로그인합니다.
   3. 작동 인터페이스의 왼쪽 위 모서리(그림 3)에서 원형 화살표 아이콘 중 하나를 탭하여 연동 펌프의 회전 방향을 설정합니다. 인터페이스의 오른쪽 패널에서 위/아래 화살표 아이콘을 탭하여 해당 매개변수의 값을 설정합니다. 흐름을 상수 흐름 모드로 설정하십시오. 히터 재킷의 온도를 42°C로 (방향제의 온도가 37°C로 유지되도록 조정됨); ~ 33 mL / min의 유속으로 38 rpm의 펌프 속도.
   4. 작동 인터페이스의 오른쪽 하단 패널에서 버블 알람, 관류 정지 알람 및 음소거 아이콘의 상태를 확인합니다.
   5. 왼쪽 패널에서 향수의 온도, 압력 및 유량을 확인합니다. 열의 위쪽과 아래쪽에 있는 위쪽-아래쪽 화살표를 클릭하여 간격을 수동으로 설정합니다. 열 중간에 값으로 표시된 실시간 데이터를 확인합니다. 실시간 데이터가 설정된 범위를 벗어나면 열의 색상이 녹색에서 빨간색으로 바뀝니다.
   6. 관류를 시작, 일시 중지 및 중지할 아이콘과 중간 패널의 실시간 데이터 표시에서 차트 모드로 전환할 아이콘을 찾습니다. 시작 아이콘을 탭하여 관류를 시작하고 칼슘이 없는 버퍼로 튜브를 프라이밍합니다. 새 로그가 만들어집니다. 팝업 창에 파일 이름과 사용자 이름을 입력합니다(그림 4).

그림 3: 작업 인터페이스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 파일 이름과 사용자 이름을 묻는 팝업 창. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. 드립 챔버를 반쯤 채우십시오. 프라이밍 중에 튜브에 갇힌 공기 포켓이 없는지 확인하십시오.
6. 버블 필터의 하류에 형성되는 모든 버블을 튜브에서 플릭하여 버블을 분리하고 플러시되도록 하여 제거합니다.
   참고: 버퍼가 히터 재킷에 의해 예열될 때 튜브를 따라 거품이 형성될 수 있습니다.
7. 400mL 비이커에 콜라게나제 버퍼 200mL를 채운다. 무대를 비이커 위에 올려 놓으십시오. 튜브에 공기를 유입시키지 않고 튜브 입구 중 하나의 롤러 클램프를 완전히 조이고 입구의 흡인 피펫을 비이커로 옮깁니다.

3. 동물 절차

1. 젊은 성인 남성 Wistar 쥐를 체중으로 약 200-300g을 준비하십시오.
   참고 :이 프로토콜은 체중이 약 200-300g 인 쥐에게 최적화되었습니다. 수컷 래트는 암컷 래트의 발정주기 동안 호르몬 변화가 간세포 기능에 영향을 미치기 때문에 선호된다.
2. 마취
   1. 필요한 부피의 항응고제 헤파린(5,000 IU/mL, 0.2 mL/100 g 체중)과 쥐 마취 케타민/자일라진 칵테일(케타민 37.5 mg/mL, 5 mg/mL 자일라진, 0.2 mL/100 g 체중)을 27G 바늘로 1 mL 주사기에 넣습니다.
      주의: 마취와 헤파린은 유해 물질입니다. 샤프를 다룰 때는 주의해야 합니다.
   2. 쥐를 제지하십시오. 복강 내 헤파린을 주사 한 다음 케타민 / 자일라진 칵테일을 복부의 오른쪽 아래 사분면에 주입하십시오.
      참고 : caecum은 왼쪽에 위치 할 확률이 더 높습니다. 오염의 위험을 줄이기 위해 주입 중에 caecum에 구멍을 뚫지 마십시오.
   3. 10 분 후, 쥐의 양쪽 발에 페달 반사를 평가하여 마취의 깊이를 확인하십시오. 때때로 계속 확인하고 쥐가 더 이상 발가락 꼬집음에 반응하지 않을 때까지 기다리십시오. 필요에 따라 추가 마취를 주입 할 수 있습니다.
3. 쟁반 위에 알루미늄 호일로 덮인 폴리스티렌 플랫폼 위에 팔다리가 뻗어있는 수핀 위치에 쥐를 놓습니다. 쥐의 발을 테이프로 붙이고 27G 바늘로 플랫폼에 테이프를 단단히 고정하십시오.
4. 가슴과 복부를 70 % 에탄올로 분무하고 흠뻑 적셔서 소독하십시오. 소독 전에 면도하는 것은 선택 사항입니다. 쥐를 후드에 넣으십시오. 모피가 여전히 젖은 상태에서 다음 단계를 계속하십시오.
   참고 : 70 % 에탄올로 드렌칭하면 비듬과 모피 먼지가 최소한으로 유지됩니다.
5. 근육에서 피부를 분리하십시오.
   1. 한 손에 한 쌍의 치아 조직 포셉으로 복부 바닥 근처의 피부를 들어 올립니다. 다른 한편으로는 한 쌍의 날카로운 무딘 외과 용 가위로 텐트 피부를 자릅니다. 피부 밑의 가위의 날카로운 끝을 밀고 뒷다리 바로 위에서 앞다리 바로 아래까지 피부에 중간 선을 절개하십시오.
   2. 포셉으로 피부를 위로 당기고 가볍게 스트레칭하면서 가슴과 복부의 근육에 피부를 고정시키는 결합 조직을 자릅니다. 오염의 위험을 줄이려면 느슨한 모피가 근육에 떨어지는 것을 방지하십시오. 가위에 쌓인 느슨한 모피를 제거하려면 소독 된 피부 바깥쪽에서 닦아내십시오.
   3. 뒷다리 약간 위와 앞다리 약간 아래에서 쥐의 양쪽까지 중간 선에서 피부에 측면 절개를하십시오. 피부의 플랩을 옆으로 밀어 근육을 노출시킵니다.
6. 복부 근육을 잘라 장기를 노출시킵니다.
   1. 한 손에 새로운 한 쌍의 치아 조직 포셉으로 복부 바닥 근처의 근육을 들어 올립니다. 다른 한편으로는 무딘 무딘 외과 용 가위 한 켤레를 사용하여 장기를 자극하지 않고 조심스럽게 근육을 자릅니다. 뒷다리 약간 위에서 흉골까지 근육을 중간 선 절개하십시오.
   2. 뒷다리 약간 위와 흉곽 바로 아래에서 쥐의 양쪽에 중간 선에서 양쪽으로 근육을 옆으로 절개하여 장기를 자극하지 마십시오. 근육의 플랩을 옆으로 밀어 장기를 노출시킵니다. 피부와 근육의 측면 절개가 쥐의 측면에 도달하여 혈액과 완충액이 나중에 복강에서 흘러 나올 수 있도록하십시오.
7. 포털 정맥 통조림
   1. 구부러진 집게의 뒤쪽으로 장을 부드럽게 오른쪽으로 밀어 넣으십시오. 간엽을 부드럽게 뒤집어 포털 정맥을 노출시킵니다.
   2. 3-0 실크 외과 봉합사를 사용하여 정맥이 좌우로 다른 간 엽으로 들어가기 직전에 간에서 가까운 포털 정맥 주위에 매우 느슨한 합자를 만드십시오. 포털 정맥을 통한 혈류를 방해하지 않도록 합자를 조이지 마십시오. 담관 아래의 매우 얇은 막은 봉합사가 아래를 통과하고 포털 정맥 (및 담관) 주위를 반복하기 전에 곡선 포셉의 끝으로 부러져야합니다.
   3. 두 쌍의 구부러진 포셉의 끝을 사용하여 포털 정맥을 손상시키지 않고 포털 정맥 아래의 조직을 통해 조심스럽게 구멍을 뚫습니다. 위 정맥이 포털 정맥에서 분기하기 직전에 첫 번째 합자의 상류에서 약 2-3cm 정도 이렇게하십시오. 조직은이 특정 위치에서 더 얇습니다.
   4. 포셉으로 조심스럽게 구멍을 크게 뻗습니다. 이 구멍은 포셉이 캐뉼레이션 중에 포털 정맥을지지 할 수있게합니다.
   5. ~ 3 mL / min의 유속을 위해 펌프 속도를 4 rpm으로 줄입니다. IV 카테터에서 칼슘이없는 완충액의 유출이 느린 물방울로 감소되도록하십시오.
      참고: 간에서 압력이 축적되면 간세포 사망이 발생합니다. 더 낮은 유속은 나중에 단계에서 캐뉼라를 포털 정맥에 성공적으로 삽입 할 때 간에서 축적되는 압력을 늦추어야합니다.
   6. 포셉을 사용하여 포털 정맥을 부드럽게 지지하십시오. 다른 한편으로는, 바늘의 경사가 위를 향하게하여 IV 카테터를 잡으십시오. 바늘을 10-20 ° 각도로 포털 정맥에 넣고 전체 경사가 정맥 내부에있을 때까지 천천히 전진하십시오. 바늘이 포털 정맥에 올바르게 삽입되면 간이 붉어지기 시작하고 짙은 붉은 색을 잃게됩니다.
      참고 : 바늘의 전체 경사는 캐뉼라를 삽입하기에 충분히 큰 구멍을 만들기 위해 정맥에 삽입되어야합니다. 그러나 정맥에 구멍을 뚫지 않도록 바늘을 너무 깊게 삽입하지 마십시오.
   7. 캐뉼라를 바늘 위와 정맥으로 전진시킵니다. 그런 다음 캐뉼라 뒤에서 2-3 mm가 될 때까지 바늘을 후퇴시킵니다. 날카로운 팁이 캐뉼라 내에 안전하게 들어갈 수있을만큼 충분합니다. 엄지 손가락과 가운데 손가락을 사용하여 카테터를 잡고 집게 손가락을 사용하여 날개를 뒤로 당겨 바늘을 수축시킵니다.
   8. 정맥 클립으로 포털 정맥을 카테터에 빠르게 고정하십시오. 향수 흐름을 방해하지 않도록 바늘의 측면 구멍에 직접 클립하지 마십시오. 대신 그 아래에 클립하십시오.
   9. 즉시 간에서 압력이 축적되는 것을 방지하기 위해 infrahepatic 열등한 정맥 카바 (IVC)를 잘라냅니다. 지금까지 infrahepatic IVC와 인접한 혈관은 포털 정맥의 혈액에 의해 가려질 것입니다. IVC가 올바르게 절단되고 절단되었는지 확인하려면 맥박으로 분출하는 혈액을 관찰하십시오. 혈액은 인접한 혈관에서만 흘러 나옵니다.
      참고 : 다음 단계로 넘어 가기 전에 cannulation 또는 절단하지 못한 후 infrahepatic IVC를 자르는 데 너무 오래 걸리면 간세포 사망이 발생합니다. 동물은이 단계 동안 삼출 (IVC의 절단을 통해)에 의해 마취하에 안락사됩니다. 혈액 손실이 진행되는 동안 절차는 계속되어야합니다. 사망은 나중에 흉강이 열릴 때 심장 박동 / 호흡이 중단되는 시각적 관찰을 통해 확인할 수 있습니다.
   10. ~ 33 mL/min의 유속을 위해 펌프 속도를 38 rpm으로 증가시키십시오. IVC를 2-3 초 동안 포셉으로 닫고 (너무 길지는 않음) 간을 세 번 플러시하고 다시 여십시오.
       참고 : 홍조 중에는 간이 약간 확장되어 정상으로 돌아갑니다. 홍조는 간 전체에 걸쳐 향수의 침투를 촉진합니다. 홍조 후, 간은 완전히 밝은 갈색이어야합니다.
   11. 모든 간 엽의 관류를 보장하기 위해 포털 정맥이 다른 간 엽으로 분기하는 지점 전에 캐뉼라 팁이 배치되도록하십시오. 필요한 경우 포털 정맥의 클립을 풀고 캐뉼라의 위치를 조정하십시오. 나중에 다시 클립하십시오.
   12. 분기점의 약간 상류에서 포털 정맥 주위의 느슨한 합자를 조이십시오. 부드러운 캐뉼라가 경질 금속 바늘에 의해지지되는 곳, 경사와 측면 구멍 사이에 세 개의 매듭을 만드십시오. 매듭이 캐뉼라를 제자리에 고정시키고 포털 정맥에 고정시키고 버퍼의 역류를 방지하는지 확인하십시오.
8. 간 전체를 그대로 절제하십시오.
   1. 다음 12분 동안 ~33mL/min의 유속으로 칼슘이 없는 완충액으로 간을 관류시킵니다( 그림 5A 참조). 그 동안 간 절제술을 수행하십시오. 필요한 경우 관류 시간을 연장 할 수 있지만 칼슘이없는 버퍼가 부족하지 않도록하십시오.
   2. 한 쌍의 구부러진 가위를 사용하여 서로 연결하는 장간막을 절단하여 포털 정맥을 장에서 조심스럽게 분리하십시오. 오염이 발생하지 않도록 위장관 (식도, 위 및 소장 및 대장)에 닉을 붙이지 마십시오.
      참고 : 이것은 절제술 중에 간이 움직일 때 문맥 정맥이 찢어지는 것을 방지하기위한 것입니다.
   3. 간을 위장관에 연결하는 결합 조직, 췌장 및 장간막을 절단하여 위장관에서 간을 분리하십시오. 분리하려면 항상 가위로 자르고 찢어지지 마십시오. 다시 말하지만, 위장관을 닉하거나 자르지 마십시오.
   4. 횡격막을 노출시키기 위해 간을 부드럽게 뒤집습니다. 갈비뼈의 벽을 따라 횡격막을 자릅니다. 횡격막의 대부분이 간과 연결되어 있는지 확인하십시오. 간을 찌르거나 타박상을 입지 않도록주의하십시오.
   5. 흉강이 열리면 왼쪽의 희끄무레 한 suprahepatic IVC와 오른쪽의 황색 식도라는 두 개의 덕트가 보일 수 있습니다. 초라헤파틱 IVC를 클립하고 클립 바로 위에 잘라냅니다. 초라페파틱 IVC를 클리핑하는 것은 선택 사항입니다. 그것은 흉강이 침수되는 것을 방지합니다.
      참고 : 동물의 죽음을 확인하기 위해 심장 박동 / 호흡 중단을 시각적으로 관찰하십시오.
   6. 식도는 횡격막으로 둘러싸여 있습니다. 횡격막에서 식도를 분리하려면 횡격막을 오른쪽에서 식도로 자릅니다. 식도와 위를 간과 횡격막에 연결하는 나머지 결합 조직을 잘라냅니다.
   7. 위장관을 오른쪽으로 밀어 내십시오. 정맥 클립을 수프라헤파틱 IVC로부터 인프라게파틱 IVC로 옮기는 단계; 버퍼는 이제 suprahepatic IVC에서 정독 할 것입니다.
      참고 : 관류 중에 캐뉼라와 infrahepatic IVC는 간으로 덮여 있습니다. suprahepatic IVC로부터의 강력한 버퍼 유출은 외과 의사가 관류 누출을 배제하는 데 도움이됩니다.
   8. 간을 흉강에 연결하는 나머지 횡격막을 자르십시오. 간과 복강을 연결하는 조직을 차단하십시오. 클립 위의 infrahepatic IVC를 자르지 않도록 주의하여 클립이 간에서 분리되지 않도록 하십시오.
   9. 간이 완전히 절제되도록하려면 포셉으로 횡격막을 잡고 조심스럽게 간을 들어 올립니다. 간과 복강을 연결하는 나머지 조직이 있으면 잘라냅니다. 신장과 비장이 여전히 간과 연결되어 있으면 분리하십시오.

4. 간 관류와 소화

1. 절제술이 일찍 완료되면 간이 칼슘이없는 완충액으로 관류 될 때까지 12 분 동안 기다리십시오.
2. 관류 완충액을 콜라게나제 완충액으로 변경한다. 칼슘이 없는 버퍼용 롤러 클램프를 완전히 조이기 전에 콜라게나제 버퍼용 롤러 클램프를 완전히 풉니다( 그림 5B 참조). 콜라게나제 완충액이 튜브를 통해 간장에 도달하면, 2-3초 동안 초라게파틱 IVC를 닫고 다시 열어 간을 3번 플러시합니다.
3. 콜라게나제 버퍼의 재순환을 위해 간을 비이커 상단의 무대로 조심스럽게 옮깁니다. 카테터를지지하면서 포셉으로 횡격막을 잡고 간을 움직입니다. 우발적 인 카테터 박리를 방지하기 위해 카테터를 잡아 당기지 마십시오.
   참고: 카테터가 분리되고 포털 정맥이 너무 손상되어 재관식을 할 수 없는 경우, 초라게파틱 IVC를 캐뉼레이트하고 버퍼가 포털 정맥에서 관류되도록 합니다. infrahepatic IVC가 잘린 상태로 남아 있는지 확인하십시오.
4. 간을 12 분 동안 소화하십시오. 간이 부드러운 갈색 질감을 잃기 시작할 때 반투명 반점 / 네트워크의 출현을 관찰하십시오. 간은 소화됨에 따라 더 커지고 부드러워집니다. 간이 끈적 끈적한 일관성을 가지면 관류를 중단하십시오. 필요한 경우 소화 시간을 연장 할 수 있습니다.
   참고: 글리슨의 캡슐이 파손된 경우, 비커의 콜라게나제 버퍼가 탈출한 간 세포로 인해 흐려질 수 있습니다.

5. 간세포 분리

1. 포털 정맥을 차단하여 캐뉼라를 조심스럽게 제거하십시오. 클립을 조심스럽게 분리합니다. 간을 차가운 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 60mL가 들어있는 150mm 접시로 옮깁니다.
2. 구부러진 포셉의 뒷면을 사용하여 간을 부드럽게 두드려 Glisson의 캡슐을 부수고 벗겨냅니다. 그런 다음 DMEM에서 간을 좌우로 부드럽게 흔들어 간 세포를 방출합니다. 간 세포가 DMEM에 완전히 해리 될 때까지이 작업을 계속하십시오.
   참고 : 때로는 전체 간 또는 특정 엽이 부분적으로 만 소화됩니다. 강제로 제거될 간을 긁어내지 않고, 해리되지 않은 간세포를 손상시킴으로써, 더 높고 일관된 세포 생존력을 얻을 수 있다.
3. 간 세포가 DMEM에 잘 분포 될 때까지 150mm 접시를 부드럽게 흔든다. 조직 조각 및 세포 덩어리를 제거하기 위해, 새로운 150 mm 접시 위에 놓인 100 μm 공극 크기 나일론 메쉬 필터를 통해 세포 현탁액을 부어라. 오래된 접시를 30mL의 DMEM으로 헹구고 현탁액을 메쉬 필터로 옮깁니다. 메쉬 필터를 부드럽게 탭하여 갇힌 단일 간 세포가 통과 할 수 있도록하십시오.
4. 메쉬 필터를 제거하고 간 세포가 잘 분포 될 때까지 새로운 150mm 접시를 부드럽게 흔든다. 현탁액을 4 x 50 mL 튜브로 균등하게 나눈다. 접시를 DMEM 30mL로 헹구고 현탁액을 동일한 튜브로 똑같이 나눕니다. 각 튜브에 동일한 부피의 셀 현탁액이 있는지 확인하십시오.
5. 세포 현탁액의 4 x 50 mL 튜브를 4°C에서 2분 동안 50 x g 에서 원심분리한다. 느슨한 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 조심스럽게 흡인하십시오. 상층액을 버리십시오. DMEM 20mL를 각 튜브에 넣고 튜브를 부드럽게 흔들어 세포 펠릿을 재현탁시킵니다. 네 개의 튜브에서 두 개의 튜브로 세포 현탁액을 결합하십시오.
6. 2 x 50 mL 튜브를 4°C에서 2분 동안 20 x g 에서 원심분리한다. 상층액을 흡인하고 버립니다. DMEM 20mL를 각 튜브에 넣고 튜브를 부드럽게 흔들어 세포 펠릿을 재현탁시킵니다. 두 개의 튜브에서 하나의 튜브로 세포 현탁액을 결합하십시오. 사용할 때까지 세포를 얼음 위에 보관하십시오.
7. 400 μL의 1x PBS와 50 μL의 트리판 블루를 혼합하여 트리판 블루 용액을 제조하였다. 50 μL의 간세포 현탁액을 트리판 블루 용액에 첨가한다. 광학으로 혈구계가있는 생존 가능한 간세포와 죽은 간세포의 수를 광학 현미경으로 계산하십시오.

6. 간세포 배양

1. 후드의 모든 세포 배양 단계를 수행하십시오. 콜라겐 코팅액 1 mL를 35 mm 디쉬에 넣고 4시간 동안 배양한다. 1x PBS로 접시를 세 번 헹구십시오.
2. 간세포 배양 배지에서 간세포 현탁액을 0.8 백만 세포 / mL의 농도로 희석하십시오. 희석된 간세포 현탁액 1 mL를 35 mm 접시에 첨가한다.
   참고: 간세포는 피펫팅 중 전단 스트레스에 민감합니다. 넓은 보어 피펫 팁 사용을 고려하십시오.
3. 간세포를 고르게 분배하기 위해 접시를 흔든다. 간세포가 부착될 수 있도록 37°C, 5%_CO2 에서 3-4시간 동안 인큐베이션한다.
4. 샌드위치 문화를 위해.
   1. 간세포 배양 배지를 제거한다. 간세포 배양액 1mL로 1회 헹구어 부착되지 않은 세포를 제거한다. 콜라겐 오버레이 용액 1 mL를 첨가한다. 콜라겐 오버레이 용액을 접시의 벽에 첨가하여 용액에 거품이 생기지 않도록하십시오.
   2. 콜라겐 겔화를 허용하기 위해 하룻밤 동안 37°C, 5%_CO2 에서 인큐베이션한다.
   3. 신선한 간세포 배양 배지 1 mL를 첨가한다. 37°C, 5%_CO2에서 인큐베이션한다.
5. 단층 문화용.
   1. 단계 6.3 이후, 간세포 배양액을 제거한다. 간세포 배양액 1 mL로 1회 헹구어 부착되지 않은 세포를 제거하였다.
   2. 신선한 간세포 배양 배지 1 mL를 첨가한다. 37°C, 5%_CO2에서 인큐베이션한다.
6. 앞서^10,11에 기재된 바와 같이 간세포 특이적 마커 및 기능적 검정에 대한 면역염색을 수행하여 간세포 순도 및 기능을 평가한다.

결과

외과 의사는 특정 단계 후 결과를 관찰하여 간 관류가 원활하게 진행되고 있는지 여부를 알 수 있습니다. 첫 번째 결과는 캐너레이션, infrahepatic IVC의 절단 및 관류 유량 복원시 관찰 될 수 있습니다. 간은 볼륨을 유지하면서 진한 빨간색에서 갈색으로 완전히 변했어야합니다. 간이 약간 수축되어 보이고 붉은 색조 또는 붉은 색의 얼룩이있는 경우, 관류 유량이 잘못 설정되었거나 (너무 낮음) 포털 ...

토론

일반적으로 두 단계 콜라게나제 관류 절차에 대해 관찰하는 것이 특히 중요한 몇 가지 점이 있다. 첫째, 간을 절제할 때 특별한주의를 기울여야합니다. 내용물이 누출되면 박테리아 오염이 발생할 수 있으므로 위장관이 손상되지 않도록하십시오. 또한 동물 절차 중에 간 표면을 덮는 Glisson의 캡슐을 손상시키지 마십시오. 눈물이 충분히 크면 콜라게나제 완충액으로 분리된 간세포의 조기 방출을 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material/Equipment
1 mL syringe	Nipro
27G needle	Nipro
Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture	Look	SP117
Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip	Bochem	10333511
Disposable Perfusion Set	Vasinfuse	BPF-112
Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack	Sigma-Aldrich	R3133
German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1×2 teeth , 14.5cm	Walentech
Greiner Cellstar aspirating pipette	Merck	GN710183
Haemocytometer
Integrated Perfusion System	Vasinfuse	IPS-001
Iris Scissors curved, stainless, 11cm	Optimal Medical Products Pte Ltd	CVD
Light microscope with 10X lens	Olympus
Mesh Sheet 100µM Nylon	Spectra-Teknic(s) Pte Ltd	06630-75
Operating Scissors, BL/BL, 13cm	Optimal Medical Products Pte Ltd	STR – BL/BL
Operating Scissors, SH/BL, 13cm	Optimal Medical Products Pte Ltd	STR – SH/BL
Reverse force hemostatic clip	Shanghai Jin Zhong Pte Ltd	XEC230
Water bath	Grant
Reagents/Chemicals
10X Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9056
CaCl2·2H2O	Merck	137101
Collagenase Type IV	Gibco	17104019
Dexamethasone	TCI	D1961
DMEM	Gibco	31600-034
Glutamax	Gibco	35050061
HEPES	Invitrogen	11344-041
Insulin	Sigma-Aldrich	1-9278
KCl	VWR	VWRC26764.298
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379
Linoleic acid	Sigma-Aldrich	L9530
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S8875
NaOH	Merck	106462
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Type I bovine collagen	Advanced BioMatrix	5005-100ml
William’s E Media	Sigma-Aldrich	W1878