Ringraziamo Colby Carpenter e Spencer Mathias per la loro assistenza nella progettazione della stampa 3D. Ringraziamo Ellen Klinger per l'assistenza nella produzione delle figure fotografiche e Jonathan B. Koch per aver fornito assistenza con le revisioni. Il finanziamento è stato fornito dall'USDA-ARS-Pollinating Insect Biology, Management, and Systematics Research Unit.

1. Stampa le strutture delle trappole per polline
<ol><li>Scarica il file STL appropriato per la scatola nido in cui nidificano i bombi (ad esempio, alveari in stile Biobest o Koppert, https://www.ars.usda.gov/pacific-west-area/logan-ut/pollinating-insect-biology-management-systematics-research/docs/pollen-traps/). I file sono disponibili al pubblico, gratuitamente per il download e la modifica da parte dell'utente finale.</li>
	<li>Aprire il file STL nel programma della stampante. Seguire le istruzioni del produttore della stampante per creare i quattro componenti trap. NOTA: consentire circa 3 ore per la stampa del corpo della trappola, 2 ore per la stampa del bacino di cattura e 30 minuti ciascuna per la stampa del filtro e dell'inserto di chiusura della trappola. La dimensione del corpo della trappola è di 6 cm x 3,8 cm x 7 cm.</li>
</ol>2. Assemblaggio della trappola del polline
<ol><li>Rimuovere le strutture di supporto stampate con il corpo della trappola e il bacino di cattura, comprese quelle della struttura del setaccio del corpo della trappola (Figura 1).</li>
	<li>Utilizzare una punta da trapano da 3/16 pollici (0,476 cm) montata in un trapano a mano per eliminare eventuali fili di plastica che attraversano i bordi rialzati del filtro antipolline che potrebbero impedire a un'ape di muoversi attraverso i fori del filtro. Utilizzare una lama di rasoio e carta vetrata per uniformare eventuali urti o bordi rialzati sul lato piatto del filtro antipolline.</li>
	<li>Posizionare il filtro antipolline nel corpo della trappola spingendo delicatamente il filtro di plastica attraverso un lato del corpo della trappola. Il filtro si adatta solo in un modo, poiché il lato sinistro della trappola ha un'apertura più grande per ospitare il passaggio dei coni filtranti sollevati.<ol>
<li>Se le fessure laterali sono troppo piccole perché il filtro antipolline possa scorrere senza intoppi, raschiare abbastanza plastica lontano dalla fessura nel corpo della trappola con un rasoio o un altro strumento in grado di rimuovere piccole porzioni di plastica alla volta. Assicurarsi che il filtro antipolline si adatti saldamente in posizione con uno spazio non superiore a 2 mm tra il filtro antipolline e il corpo della trappola.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Attaccare il bacino di cattura al corpo della trappola facendo scorrere i bordi rialzati sul fondo del corpo della trappola nella scanalatura sulla parte superiore del bacino di cattura. Il bacino di cattura deve essere posizionato direttamente sotto la regione del setaccio del corpo della trappola (Figura 1A\u2012E).</li>
	<li>Apportare le modifiche appropriate tagliando o levigando la plastica per consentire un posizionamento e una rimozione fluidi del bacino di cattura dal corpo della trappola. Il posizionamento del bacino di cattura proteggerà il filtro antipolline in posizione e non potrà essere rimosso fino a quando il bacino di cattura non viene rimosso, né il filtro antipolline può essere inserito mentre il bacino di cattura è in posizione. NOTA: se più alveari sono posizionati l'uno vicino all'altro, fornire a ciascun alveare una combinazione di colori unica del corpo della trappola, del bacino di cattura e delle strutture del filtro antipolline, oltre a distribuire alveari con orientamento vario, aiuterà i lavoratori di ritorno a trovare i loro nidi.</li>
</ol>3. Preparazione della colonia di bombi
<ol><li>Interrompere l'alimentazione del polline 24\u201248 h prima di dispiegare colonie. Ciò farà sì che i lavoratori utilizzino il polline immagazzinato e li stimolino a lasciare il nido in cerca di polline.</li>
	<li>Preparare il corpo della trappola dell'alveare per l'installazione inserendo un inserto di chiusura della trappola nello slot del filtro per evitare che le api fuoriesceno durante l'installazione della trappola.</li>
	<li>Lavorando sotto la luce rossa per impedire alle api di volare, sollevare la scatola del nido di plastica dalla scatola esterna di cartone.</li>
	<li>Individua l'ingresso del nido di plastica nella parte anteriore del nido. Esistono due stili di ingresso a seconda del fornitore del nido: scatole in stile Koppert (passaggio 3.5) e scatole in stile Biobest (passaggio 3.6).</li>
	<li>Per gli ingressi dell'alveare in stile Koppert, montare la trappola per polline sull'ingresso del nido tirando su la linguetta d'ingresso fino a quando entrambi i fori di ingresso sono aperti.<ol>
<li>Inserire i due tubi della trappola per polline nei fori di ingresso, assicurandosi che il setaccio della trappola per polline sia sul fondo. Spingere delicatamente verso il basso sulla linguetta d'ingresso in plastica per fissare la trappola antipolni in posizione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per installare la trappola per polline negli ingressi dell'alveare in stile Biobest, utilizzare un cacciavite a testa piatta per estrarre delicatamente il dispositivo di ingresso in plastica dalla scatola del nido. Inserire la trappola per polline nei fori di ingresso del nido fino a quando la trappola per polline non è saldamente contro il nido (Figura 1E).<ol>
<li>Fissare la trappola al nido usando del nastro adesivo o della colla a secco rapido in cui la trappola contatta la scatola del nido, se necessario.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Restituire la scatola nido di plastica alla scatola di cartone. Potrebbe essere necessario tagliare il cartone per ospitare la trappola del polline.</li>
</ol>4. Distribuzione dei nidi
<ol><li>Posiziona le cassette nido nell'area di studio. Fornire copertura per proteggere dalle precipitazioni e dall'ancoraggio per il vento in quanto questi possono influire negativamente sulla qualità e sulla quantità di polline che viene raccolto. Fornire alveari collocati in serre con un'adeguata copertura solare per ridurre il surriscaldamento.</li>
	<li>Rimuovere l'inserto di chiusura della trappola dal corpo della trappola per consentire alle api di foraggiare liberamente in modo che i raccoglitori possano orientarsi con l'area circostante e la posizione del loro nido. Il tempo di volo di orientamento dovrebbe essere completato in 24 ore in condizioni normali.</li>
</ol>5. Raccolta del polline
<ol><li>Per innestare la trappola, far scorrere il filtro antipolline nello slot del filtro, assicurandosi che sia saldamente in posizione.</li>
	<li>Installare il bacino di cattura facendolo scorrere sul corpo della trappola dalla parte anteriore fino a quando non è completamente chiuso. Se il bacino di cattura è eccessivamente allentato o cade dal corpo della trappola, utilizzare un elastico per fissarlo al corpo della trappola.</li>
	<li>Osserva le api che entrano ed escono dalla trappola del polline al primo dispiegamento per assicurarti che i fori del filtro antipolline siano abbastanza grandi da ospitare le api.<ol>
<li>Se i lavoratori non sono in grado di passare attraverso il filtro antipolline, rimuovere il filtro e quindi utilizzare punte più grandi di 3/16 pollici (0,476 cm) per aumentare le dimensioni dei fori. Fallo in modo sequenziale, aumentando il diametro del foro di 1/32 in. (0,079 cm) ogni volta, poiché i fori troppo grandi non raccoglieranno alcun polline.</li>
		<li>Una volta che le api sono in grado di passare attraverso il filtro, continua a osservare l'ingresso per assicurarti che il polline venga rimosso al rientro. NOTA: Le api dovrebbero avere qualche difficoltà a muoversi attraverso i fori del filtro antipolline, specialmente le prime volte che passano. Se passano troppo facilmente, il polline non può essere rimosso dalle corbicole.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo il periodo designato di raccolta del polline, far scorrere e rimuovere il bacino di cattura dal corpo della trappola.</li>
	<li>Elabora i carichi di polline secondo il tuo progetto sperimentale.</li>
	<li>Rimuovere il filtro antipolline per consentire ai lavoratori di foraggiare liberamente fino al prossimo periodo di raccolta del polline. Il corpo della trappola può rimanere attaccato all'alveare per tutta la durata dell'esperimento. NOTA: Le trappole di polline possono essere impegnate per tutto il tempo in cui il ricercatore desidera raccogliere il polline da una colonia. Tuttavia, il dispiegamento di trappole di polline per oltre 24 ore in una settimana può causare la fame di covata in un alveare e ritardare lo sviluppo della colonia.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La raccolta di polline dagli ingressi delle colonie di bombi può consentire una varietà di studi ecologici e agricoli. Identificare le fonti floreali da cui i bombi raccolgono il polline fornisce preziose informazioni e informazioni sulla diversità delle piante che contribuiscono alla dieta generale di una colonia19. Identificare la fonte di polline ha implicazioni sia per la produzione agricola che per gli studi sui servizi ecosistemici nelle terreselvagge12,...

I bombi (Bombus spp.) sono grandi insetti robusti che si trovano nelle regioni temperate, alpine e artiche del mondo1. Sono importanti per le comunità vegetali e forniscono un importante servizio di impollinazione per le colture agricole che visitano2. Il recente declino dell'abbondanza e della distribuzione di diverse specie ha portato la loro importanza come impollinatori in prima linea nella consapevolezza pubblica3. I ricercatori hanno identificato diversi fattori di stress che probabilmente contribuiscono al declino della popolazione, tra cui la mancanza di risorse floreali diverse e abbondanti su cui i bombi si nutrono4. Identificare da quali specie vegetali i bombi si foraggiano consente ai ricercatori e ai gestori del territorio di capire come i bombi possono rispondere ai cambiamenti nella disponibilità delle risorse, nella competizione e nei disturbi antropogenici5,6.
Gli studi che indagano le preferenze di foraggiamento del polline dei bombi sono spesso condotti da ricercatori che catturano singole api che si foraggiano ai fiori e quindi rimuovono i carichi di polline corbicolare dai campioni per un'ulteriore elaborazione e identificazione7,8,9,10. Mentre questo metodo fornisce informazioni su come una specie o un assemblaggio di specie di bombi utilizza le risorse in un'area7, è dispendioso in termini di tempo e le potenziali differenze nelle preferenze tra gli alveari non possono essere individuate senza ulteriori analisi molecolari per identificare la colonia di origine dell'ape foraggiatrice11.
Per alcuni studi di dinamica del foraggiamento, si desidera condurre gli studi presso singole colonie; tuttavia, i nidi di bombi selvatici si trovano generalmente sottoterra o a livello del suolo, il che li rende difficili da individuare12. Gli alveari di bombi prodotti commercialmente forniscono ai ricercatori un maggiore accesso e un migliore controllo sperimentale e la rimozione del polline dai lavoratori è ancora condotta principalmente catturando i raccoglitori mentre tornano all'alveare e rimuovendo manualmente i loro carichi di polline corbicolare13,14. La rimozione del polline a mano dalla corbicola di un'ape richiede molto tempo con una bassa resa oraria di polline, specialmente agli ingressi dell'alveare dove il tasso di ritorno dei raccoglitori di polline può essere basso. Inoltre, la rimozione manuale del polline dalle api può provocare punture da parte di lavoratori disturbati.
Le trappole di polline sono state utilizzate per la rimozione sperimentale del polline dalle api mellifere per decenni15; tuttavia, non è stato sviluppato un metodo passivo per rimuovere il polline dai bombi. L'ostacolo principale nello sviluppo di un meccanismo per rimuovere il polline dai bombi raccoglitori di ritorno è la grande variazione delle dimensioni dei lavoratori che esistono in una colonia di bombi16. Le trappole per il polline delle api da miele sono efficaci in gran parte perché le dimensioni dei lavoratori delle api da miele non variano molto. Inoltre, queste trappole richiedono solo piccole manipolazioni dopo l'installazione e non richiedono che le api vengano sacrificate17. Ciò si ottiene utilizzando schermi o superfici di plastica che spostano il polline dalle zampe posteriori dei lavoratori mentre tornano all'alveare. Queste trappole rimuovono solo una parte dei carichi di polline dai raccoglitori di ritorno e i vari disegni di questi si traducono in varie efficienze nella raccolta del polline. Quando il polline viene rimosso dalle zampe delle api, cade attraverso uno schermo e in un bacino di raccolta a cui le api non hanno accesso, in modo che il ricercatore possa rimuoverlo con solo lievi disturbi all'alveare.
Lo scopo del presente studio è quello di adattare le tecniche utilizzate per la raccolta del polline dagli alveari delle api da miele e applicarle ai nidi di bombi utilizzando strutture stampate in 3D e testare i disegni delle trappole su colonie di Bombus huntii. Il processo di progettazione ha seguito i presupposti che le trappole dovrebbero essere poco costose da produrre, adattabili a una varietà di specie di bombi, causare danni o disturbi minimi alle api e che il tasso di rimozione del polline dovrebbe superare la raccolta manuale del polline. La tecnologia di stampa tridimensionale è versatile, facilmente accessibile e uno strumento economico che consente ai ricercatori di replicare e modificare oggetti per scopi specifici18. La tecnica qui presentata istruisce l'utente a costruire trappole per polline e attaccarle a colonie di bombi disponibili in commercio. Le trappole non sono progettate per essere utilizzate con colonie selvatiche. Queste trappole rimuovono passivamente i carichi di polline corbicolare dalle zampe posteriori dei bombi che trasportano i bombi mentre tornano alle loro cassette nido.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:461px;" width="462">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:71px;">MakerBot Replicator+</td>
			<td style="width:87px;">MakerBot</td>
			<td style="width:87px;">Model PABH65</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:71px;">MakerBot Tough Material</td>
			<td style="width:87px;">PLA Filament</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td>various colors</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:71px;">Nest Box</td>
			<td style="width:87px;">Biobest</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td>Not sold publicly without bee purchase</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a 3d printed pollen trap for bumble bee (bombus) hive entrances

Per verificare le fonti vegetali da cui i bombi si foraggiano per il polline, gli individui devono essere raccolti per rimuovere i loro carichi di polline corbicolare per l'analisi. Questo è stato tradizionalmente fatto facendo rete ai raccoglitori agli ingressi del nido o sui fiori, raffreddando le api sul ghiaccio e quindi rimuovendo i carichi di polline dalle corbicole con una pince o un pennello. Questo metodo richiede tempo e lavoro, può alterare il normale comportamento di foraggiamento e può causare incidenti pungenti per il lavoratore che esegue l'attività. Le trappole per polline, come quelle utilizzate sugli alveari delle api da miele, raccolgono il polline rimuovendo i carichi di polline corbicolare dalle gambe dei lavoratori mentre passano attraverso gli schermi all'ingresso del nido. Le trappole possono rimuovere una grande quantità di polline dalle api forager di ritorno con un lavoro minimo, ma ad oggi nessuna trappola di questo tipo è disponibile per l'uso con colonie di bombi. I lavoratori all'interno di una colonia di bombi possono variare di dimensioni rendendo difficile la selezione delle dimensioni degli ingressi per adattare questo meccanismo agli alveari di bombi allevati commercialmente. Utilizzando programmi di progettazione di stampa 3D, abbiamo creato una trappola per polline che rimuove con successo i carichi di polline corbicolare dalle gambe dei raccoglitori di bombi di ritorno. Questo metodo riduce significativamente la quantità di tempo richiesta dai ricercatori per raccogliere il polline dai raccoglitori di bombi che ritornano alla colonia. Presentiamo il design, i risultati dei test di efficienza di rimozione del polline e suggeriamo aree di modifica per gli investigatori per adattare le trappole a una varietà di specie di bombi o progetti di cassette nido.

Sono stati testati otto diversi progetti di filtri antipolline per determinarne l'efficacia e l'efficienza nel rimuovere i carichi di polline corbicolare dai lavoratori dei bombi di ritorno. Tutti i progetti sono riusciti a rimuovere almeno un carico di polline corbicolare da un raccoglitore di ritorno. Tuttavia, alcuni sono stati trovati per rallentare i lavoratori dall'uscire o entrare nell'alveare o non sono riusciti a rimuovere i carichi di polline(Tabella 1). Le trappole di polline con vari filtri ...

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A 3D Printed Pollen Trap for Bumble Bee Bombus Hive Entrances

Presentiamo un meccanismo non letale e automatizzato per raccogliere il polline dai lavoratori dei bombi(Bombus)che ritornano in un alveare. Sono incluse le istruzioni per la produzione, la preparazione, l'installazione e l'utilizzo dei dispositivi. Utilizzando oggetti stampati in 3D, la modifica del progetto è stata tempestiva, efficiente e ha consentito tempi di consegna rapidi per i test.

Una trappola per polline stampata in 3D per gli ingressi dell'alveare di Bombble Bee(Bombus)

To verify the plant sources from which bumble bees forage for pollen, individuals must be collected to remove their corbicular pollen loads for analysis.  ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A 3D Printed Pollen Trap for Bumble Bee (Bombus) Hive Entrances

5.1K Views.  Utah State University. Presentiamo un meccanismo non letale e automatizzato per raccogliere il polline dai lavoratori dei bombi(Bombus)che ritornano in un alveare. Sono incluse le istruzioni per la produzione, la preparazione, l'installazione e l'utilizzo dei dispositivi. Utilizzando oggetti stampati in 3D, la modifica del progetto è stata tempestiva, efficiente e ha consentito tempi di consegna rapidi per i test.

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Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic three-dimensional spring made of light that is formed when a high-intensity laser beam is focused to a very small spot by a microscope's objective lens. To bend a cell, we first bind live bacteria to a chemically-treated coverslip. As these cells grow, the middle of the cells remains bound to the coverslip but the growing ends are free of this restraint. By inducing filamentous growth with the drug cephalexin, we are able to identify cells in which one end of the cell was stuck to the surface while the other end remained unattached and susceptible to bending forces. A bending force is then applied with an optical trap by binding a polylysine-coated bead to the tip of a growing cell. Both the force and the displacement of the bead are recorded and the bending stiffness of the cell is the slope of this relationship.

We present a protocol for bending filamentous bacterial cells attached to a cover-slip surface with an optical trap to measure the cellular bending stiffness.

Misurare la rigidezza flessionale di cellule batteriche Utilizzando una trappola ottica

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

Ricerca

Biologia

Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

Genetic information encoded by DNA is organized in a complex and highly regulated chromatin structure. Each chromosome occupies a specific territory, that may change according to stage of development or cell cycle. Gene expression can occur in specialized transcriptional factories where chromatin segments may loop out from various chromosome territories, leading to co-localization of DNA segments which may exist on different chromosomes or far apart on the same chromosome. The Associated Chromosome Trap (ACT) assay provides an effective methodology to identify these long-range DNA associations in an unbiased fashion by extending and modifying the chromosome conformation capture technique. The ACT assay makes it possible for us to investigate mechanisms of transcriptional regulation in trans, and can help explain the relationship of nuclear architecture to gene expression in normal physiology and during disease states.

The associated chromosome trap (ACT) assay is a novel unbiased method for identifying long-range DNA interactions. The characterization of long range DNA interactions will allow us to determine the relationship of nuclear architecture to gene expression in both normal physiology and in diseased states.

Cromosoma Trappola associate per identificare interazioni a lungo raggio del DNA

Genetic information encoded by DNA is organized in a complex and highly regulated chromatin structure.  Each chromosome occupies a specific territory, ...

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not regenerate very efficiently in vivo; and as a result, osteoarthritis leads to irreversible cartilage loss and is accompanied by chronic pain and immobility 1,2. Cartilage tissue engineering offers promising potential to regenerate and restore tissue function. This technology typically involves seeding chondrocytes into natural or synthetic scaffolds and culturing the resulting 3D construct in a balanced medium over a period of time with a goal of engineering a biochemically and biomechanically mature tissue that can be transplanted into a defect site in vivo 3-6. Achieving an optimal condition for chondrocyte growth and matrix deposition is essential for the success of cartilage tissue engineering. 
 In the native joint cavity, cartilage at the articular surface of the bone is bathed in synovial fluid. This clear and viscous fluid provides nutrients to the avascular articular cartilage and contains growth factors, cytokines and enzymes that are important for chondrocyte metabolism 7,8. Furthermore, synovial fluid facilitates low-friction movement between cartilaginous surfaces mainly through secreting two key components, hyaluronan and lubricin 9 10. In contrast, tissue engineered cartilage is most often cultured in artificial media. While these media are likely able to provide more defined conditions for studying chondrocyte metabolism, synovial fluid most accurately reflects the natural environment of which articular chondrocytes reside in.
 Indeed, synovial fluid has the advantage of being easy to obtain and store, and can often be regularly replenished by the body. Several groups have supplemented the culture medium with synovial fluid in growing human, bovine, rabbit and dog chondrocytes, but mostly used only low levels of synovial fluid (below 20&#37;) 11-25. While chicken, horse and human chondrocytes have been cultured in the medium with higher percentage of synovial fluid, these culture systems were two-dimensional 26-28. Here we present our method of culturing human articular chondrocytes in a 3D system with a high percentage of synovial fluid (up to 100&#37;) over a period of 21 days. In doing so, we overcame a major hurdle presented by the high viscosity of the synovial fluid. This system provides the possibility of studying human chondrocytes in synovial fluid in a 3D setting, which can be further combined with two other important factors (oxygen tension and mechanical loading) 29,30 that constitute the natural environment for cartilage to mimic the natural milieu for cartilage growth. Furthermore, This system may also be used for assaying synovial fluid activity on chondrocytes and provide a platform for developing cartilage regeneration technologies and therapeutic options for arthritis.

A 3D system of culturing human articular chondrocytes in high levels of synovial fluid is described. Synovial fluid reflects the most natural microenvironment for articular cartilage, and can be easily obtained and stored. This system thus can be used for studying cartilage regeneration and for screening therapeutics for treating arthritis.

Un sistema 3D per condrociti articolari umani in coltura liquido sinoviale

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Analisi quantitativa di autofagia usando 3D avanzato microscopia a fluorescenza

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

Immunofluorescenza combinato e FISH DNA 3D conservato nuclei in interfase di studiare i cambiamenti in 3D Organizzazione nucleare

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Obtaining Specimens with Slowed, Accelerated and Reversed Aging in the Honey Bee Model

Societies of highly social animals feature vast lifespan differences between closely related individuals. Among social insects, the honey bee is the best established model to study how plasticity in lifespan and aging is explained by social factors.
The worker caste of honey bees includes nurse bees, which tend the brood, and forager bees, which collect nectar and pollen. Previous work has shown that brain functions and flight performance senesce more rapidly in foragers than in nurses. However, brain functions can recover, when foragers revert back to nursing tasks. Such patterns of accelerated and reversed functional senescence are linked to changed metabolic resource levels, to alterations in protein abundance and to immune function. Vitellogenin, a yolk protein with adapted functions in hormonal control and cellular defense, may serve as a major regulatory element in a network that controls the different aging dynamics in workers.
Here we describe how the emergence of nurses and foragers can be monitored, and manipulated, including the reversal from typically short-lived foragers into longer-lived nurses. Our representative results show how individuals with similar chronological age differentiate into foragers and nurse bees under experimental conditions. We exemplify how behavioral reversal from foragers back to nurses can be validated. Last, we show how different cellular senescence can be assessed by measuring the accumulation of lipofuscin, a universal biomarker of senescence.
For studying mechanisms that may link social influences and aging plasticity, this protocol provides a standardized tool set to acquire relevant sample material, and to improve data comparability among future studies.

In honey bee workers, aging depends on social behaviors rather than on chronological age. Here we show how worker-types with very different aging patterns can be obtained and analyzed for cellular senescence.

Ottenere campioni con rallentato, accelerato e invertito l&#39;invecchiamento in Honey Bee Modello

Societies of highly social animals feature vast lifespan differences between closely related individuals. Among social insects, the honey bee is the best ...

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees collect and convert to beebread by placing colonies in a specially constructed enclosed flight area. Methods were developed to analyze the protein and amino acid composition of the pollen and beebread. We also describe how consumption of the beebread was measured and methods used to determine adult worker bee hemolymph protein titers after feeding on beebread for 4, 7 and 11 days after emergence. Methods were applied to determine if genotype affects the conversion of pollen to beebread and the rate that bees consume and acquire protein from it. Two subspecies (European and Africanized honey bees; EHB and AHB respectively) were provided with the same pollen source. Based on the developed methods, beebread made by both subspecies had lower protein concentrations and pH values than the pollen. In general, amino acid concentrations in beebread made by either EHB or AHB were similar and occurred at higher levels in beebread than in pollen. Both AHB and EHB consumed significantly more of the beebread made by AHB than by EHB. Though EHB and AHB consumed similar amounts of each type of beebread, hemolymph protein concentrations in AHB were higher than in EHB. Differences in protein acquisition between AHB and EHB might reflect environmental adaptations related to the geographic region where each subspecies evolved. These differences could contribute to the successful establishment of AHB populations in the New World because of the effects on brood rearing and colony growth.

Here are methods to quantify nutrients in pollen before and after its conversion to beebread by two subspecies of honeybees. We describe techniques to measure beebread consumption and resulting protein titers in both subspecies.

Metodi per confrontare nutrienti in beebread Made by africanizzate e miele europeo api e gli effetti sulla I titoli emolinfa Protein

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

Dissezione e di osservazione di Honey Bee dorsale della nave per gli studi della funzione cardiaca

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination ...

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment methods. Here we describe methods to measure the quantities of adult bees, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, by photographing frames, and by installing hives on scales and with internal sensors. Data from these periodic evaluations are then combined with running average and daily detrended data on hive weight and internal hive temperature. The resulting datasets have been used to detect colony-level effects of imidacloprid applied in a sugar syrup as low as 5 parts per billion. The methods are objective, require little training, and provide permanent records in the form of sensor output and photographs.

Sublethal doses of pesticides may affect colonies in ways that are difficult to detect using only periodic or visual methods. Methods to measure total adult bee mass, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, photographing frames, and installing sensors, are provided. Data analysis is also addressed.

Monitoraggio effetti Colonia-livello di esposizione dell'antiparassitario subletali sulle API di miele

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

Collection and Identification of Pollen from Honey Bee Colonies

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate pesticide exposure of bees via pollen. Described herein is an effective pollen-trapping method for collecting corbicular pollen from honey bees returning to their hives. This collection method results in large quantities of corbicular pollen that can be used for research purposes. Honey bees collect pollen from many plant species, but typically visit one species during each collection trip. Therefore, each corbicular pollen pellet predominantly represents one plant species, and each pollen pellet can be described by color. This allows the sorting of samples of corbicular pollen by color to segregate plant sources. Researchers can further classify corbicular pollen by analyzing the morphology of acetolyzed pollen grains for taxonomic identification. These methods are commonly used in studies related to pollinators such as pollination efficiency, pollinator foraging dynamics, diet quality, and diversity. Detailed methodologies are presented for collecting corbicular pollen using pollen traps, sorting pollen by color, and acetolyzing pollen grains. Also presented are results pertaining to the frequency of pellet colors and taxa of corbicular pollen collected from honey bees in five different cropping systems.

We describe methods for collecting corbicular pollen from honey bees as well as protocols for color sorting, acetolysis, and microscope slide preparation of pollen for taxonomic identification. In addition, we present pellet color and taxonomic diversity of corbicular pollen collected from five cropping systems using pollen traps.

Raccolta e identificazione del polline dalle colonie di api da miele

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate ...