In questo protocollo, due anticorpi dello stesso ospite possono essere utilizzati insieme nel test di immunofluorescenza per studiare le interazioni tra cellule ospiti e patogeni. Poiché ci sono solo pochi anticorpi commerciali disponibili per riconoscere specifiche strutture cellulari e proteine nei parassiti, questo protocollo può essere molto utile. Si tratta di un protocollo di immunofluorescenza a doppia marcatura facile da eseguire che utilizza anticorpi policlonali e monoclonali allevati nella stessa specie.
Molti ricercatori potrebbero non essere consapevoli del fatto che questo è possibile. Questo approccio aiuta quando la fonte di anticorpi è limitata. Può essere utilizzato per rilevare gli agenti patogeni nelle proteine delle cellule ospiti nelle cellule ospiti infette e può anche essere applicato agli organismi viventi liberi.
Questo è un protocollo semplice, richiede un passaggio di blocco tra la prima e la seconda coppia di anticorpi. La procedura sarà dimostrata dalla dott.ssa Camila Gachet-Castro e dal dottorando Lays Trajano-Silva del mio laboratorio. Tre giorni dopo aver infettato le cellule LLC-MK2 con Trypanosoma cruzi, raccogliere il surnatante dalle cellule infette in un tubo conico di coltura cellulare da 15 millilitri.
Centrifugare il campione per abbassare i detriti cellulari, quindi posizionare il tubo a temperatura ambiente per consentire ai tripomastitonoti di nuotare verso il surnatante. Dopo 10 minuti, raccogliere il surnatante in un nuovo tubo conico, quindi centrifugare il campione e scartare il surnatante prima di rispendere il pellet contenente i parassiti in mezzo RPMI completo. Aggiungere le celle LLC-MK2 in piastre a 24 pozzetti contenenti coverslip arrotondati sterilizzati UV e lasciare che l&m si depositi per 16 ore.
Quindi, per infettare le cellule, aggiungere il surnatante contenente T.Cruzi a ciascun pozzetto e incubare per sei ore. Quindi, lavare le coperture contenenti le cellule infette e non infette cinque volte con PBS, quindi fissare le cellule con il 2% di paraformaldeide in PBS. Dopo 10 minuti, lavare le coverslip tre volte per cinque minuti ciascuna con PBS e quindi permeabilizzare le coverslips con detergente non ionico per 10 minuti.
Dopo tre lavaggi PBS di cinque minuti, incubare i coverslip in soluzione bloccante per 30 minuti, seguiti da un'altra incubazione di 30 minuti con un anticorpo monoclonale o policlonale di topo. Dopo i lavaggi PBS, incubare i coverslip per 30 minuti con anticorpi secondari in soluzione bloccante e falloidina per colorare i filamenti di actina nella cellula ospite. Quindi lavare nuovamente i coverslip con PBS tre volte prima di applicare una piccola quantità di reagente di montaggio anti-dissolvenza con mezzo DAPI sulla superficie del vetrino.
Usando la pinza, inclinare delicatamente il coperchio nel mezzo per prevenire la formazione di bolle. Per la doppia marcatura, dopo aver incubato i coverslip in soluzione bloccante come dimostrato in precedenza, incubarli nell'anticorpo policlonale del topo per 30 minuti. Quindi, lavare i coverslip tre volte per cinque minuti ciascuno con PBS prima di incubarli con l'anticorpo secondario per 30 minuti.
Quindi, dopo tre lavaggi PBS, eseguire una seconda fase di blocco con IgG anti-topo di coniglio AffiniPure diluito in soluzione bloccante. Dopo 30 minuti, lavare nuovamente le coperture con PBS prima di incubarle con l'anticorpo monoclonale del topo per altri 30 minuti. Successivamente, dopo tre lavaggi PBS, incubare i coverslip con anticorpo IgG 2B anti-topo di capra e falloidina.
Quindi, dopo tre lavaggi PBS, applicare il reagente di montaggio anti-dissolvenza come dimostrato in precedenza. Per la tripla etichettatura, dopo aver bloccato i coverslip e incubato con l'anticorpo policlonale di topo, seguito dall'anticorpo anti-topo di capra, iniziare una nuova incubazione con anticorpo policlonale di coniglio in soluzione bloccante per 30 minuti. Quindi, dopo tre lavaggi PBS, incubare i coverslip con anticorpi anti-coniglio di capra per 30 minuti.
Successivamente, dopo tre lavaggi PBS, eseguire una fase di blocco con l'anticorpo anti-topo del coniglio AffiniPure diluito in soluzione bloccante per 30 minuti. Quindi lavare nuovamente i coverslip prima di incubare con qualsiasi anticorpo monoclonale di topo della sottoclasse IgG per 30 minuti. Dopo tre lavaggi PBS, incubare i coverslip per 30 minuti con una coppia specifica di anticorpi anti-topo della sottoclasse IgG di capra.
Dopo l'incubazione, lavare le coperture tre volte per cinque minuti ciascuna con PBS. Analizzare i campioni immunofluorescenti utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo di immersione in olio 63X e rilevare la fluorescenza con un tubo fotomoltiplicatore e un rilevatore ibrido. Quindi acquisire tutte le immagini confocali con canali separati ed eseguire l'elaborazione delle immagini utilizzando Adobe Photoshop.
Queste immagini al microscopio confocale mostrano i risultati con gli esperimenti di controllo di cellule infette e non infette evidenziando la specificità degli anticorpi nella cellula ospite e nel parassita interiorizzato. L'anticorpo policlonale di topo anti-Trypanosoma cruzi FAZ ha riconosciuto la proteina gigante T.cruzi nella zona di attacco del flagello al flagello del parassita, ma non nella cellula ospite. La distribuzione della ribonucleoproteina nucleare eterogenea A1 nei nuclei è stata osservata utilizzando un anticorpo monoclonale di topo commerciale che riconosce solo le cellule di mammifero ospiti, ma non il parassita.
Inoltre, i nuclei dell'ospite e del parassita e i cinetoplasti del parassita sono stati colorati con DAPI e la F-actina dell'ospite è stata colorata con falloidina coniugata ad Alexa 594, confermando la specificità degli anticorpi. L'immunofluorescenza a doppia etichettatura mostra le distribuzioni proteiche nell'ospite e nel parassita analizzate al microscopio confocale. L'etichettatura non ha suggerito alcuna reazione incrociata tra anticorpi utilizzando questa metodologia.
In sintesi, il protocollo qui descritto per studiare le interazioni ospite-patogeno presenta una tecnica di base ed elaborata che può essere adattata a qualsiasi combinazione di anticorpi. Questo approccio rende l'immunofluorescenza economicamente vantaggiosa e può aiutare a studiare la localizzazione di due o più proteine di interesse quando sono disponibili pochi anticorpi.
