Questo protocollo descrive come la tecnica del patch clamp può essere utilizzata per studiare la capacità termogenica dei mitocondri misurando direttamente la perdita di protoni mitocondriali attraverso la membrana mitocondriale interna. La misurazione diretta della corrente protonica attraverso la membrana mitocondriale interna aiuta a identificare e caratterizzare con precisione i meccanismi molecolari responsabili della termogenesi mitocondriale. Questa tecnica consente non solo di misurare la corrente protonica attraverso la membrana mitocondriale interna, ma anche di studiare altre conduttanze importanti per la funzione mitocondriale, come il calcio o metaboliti come i nucleotidi adeninici.
Posizionare il mouse eutanasizzato sulla schiena e spruzzare alcool per pulire e bagnare i capelli. Quindi, fai un'incisione di due centimetri sul torace. Dopo aver afferrato la pelle con una pinzetta, sezionare il cuore dal petto dell'animale e risciacquarlo per rimuovere tutto il sangue in un becher da 10 millilitri con cinque millilitri di soluzione di isolamento a freddo.
Una volta che il cuore è stato ripulito da tracce di sangue, trasferirlo in un altro becher da 10 millilitri contenente cinque millilitri di tampone di isolamento a freddo e tagliarlo in pezzi sottili. Quindi, trasferirlo in un omogeneizzatore di vetro da 10 millilitri raffreddato a ghiaccio. Utilizzare un agitatore sopraelevato per omogeneizzare il tessuto pretagliato sul ghiaccio con sei colpi delicati a una velocità controllata di 275 rotazioni al minuto.
Trasferire l'omogeneizzato in un tubo conico ghiacciato da 15 millilitri e centrifugarlo a 700 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius per pellettare i nuclei e le cellule ininterrotte. Raccogliere il surnatante in un tubo fresco da 15 millilitri e metterlo sul ghiaccio. Centrifugare il surnatante a 8.500 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius per ottenere un pellet contenente i mitocondri.
Risospendare il pellet mitocondriale in 3,8 millilitri di tampone di mannitolo ipertonico ghiacciato e incubare la sospensione mitocondriale su ghiaccio per 10-15 minuti. Riempire la sospensione di mannitolo ipertonico mitocondriale in una mini-cella di pressione refrigerata della stampa francese. Quindi, posizionare la cella sulla stampa francese.
Quindi, selezionare la modalità bassa della pressa francese e comprimere la sospensione attraverso la mini-cella di pressione a 110 sul quadrante per i mitocondri del grasso bruno e a 140 per i mitocondri cardiaci, assicurandosi che la sospensione esca dalla mini-cella di pressione ad una velocità di circa una goccia al secondo. Raccogliere le gocce in un tubo conico raffreddato a ghiaccio da 15 millilitri. Centrifugare la sospensione a 10, 500 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Sospendere il pellet di mitoplasti in 0,5-2 millilitri di tampone di cloruro di potassio ipertonico ghiacciato e conservare la sospensione su ghiaccio. Tirare i filamenti di vetro borosilicato il giorno della registrazione utilizzando un estrattore di micropipette, impostando un programma sull'estrattore utilizzato per generare pipette con un alto grado di riproducibilità. Inserire un filamento di vetro all'interno dell'estrattore e tirare per ottenere quasi due pipette patch identiche da un filamento di borosilicato.
Regolare il programma quando le pipette diventano incoerenti tra i cicli di trazione a causa dell'invecchiamento del filamento della scatola di riscaldamento dell'estrattore. Posizionare la pipetta all'interno della lucidatrice della pipetta e posizionare la punta vicino al filamento sotto l'ingrandimento 100X per lucidarlo a fuoco. Premere più volte il pedale per riscaldare il filamento senza intasare o danneggiare la curva della punta.
Lucidare fino a quando le pipette non hanno una resistenza compresa tra 25 e 35 megaohm si ottengono quando riempite con soluzione di pipetta a base di TMA. Pre-incubare i coperchi scivola con gelatina allo 0,1% per ridurre l'adesione del mitoplasto e risciacquarli con la soluzione da bagno di cloruro di potassio prima di depositare la sospensione di mitoplasti. Preparare una diluizione grezza mescolando circa 35 microlitri della sospensione concentrata di mitoplasti con 500 microlitri della soluzione da bagno di cloruro di potassio e posizionarla sugli scivoli di copertura precedentemente collocati in un pozzetto di una piastra a quattro pozzetti.
Incubare sul ghiaccio per 15-20 minuti affinché i mitoplasti si sedimentino lungo lo scivolamento della copertura. Riempire completamente la camera da bagno con circa 50 microlitri della soluzione da bagno di cloruro di potassio e trasferire un coperchio con mitoplasti all'interno della camera utilizzando sottili pinzette di microdissezione con una punta piegata. Disporre lo slittamento del coperchio sul fondo della camera senza perfondere la camera per mantenere stabili i mitoplasti sullo slittamento del coperchio.
Scegli un singolo mitoplasto non adesivo scansionando il coperchio al microscopio con un obiettivo 60X. Caricare la pipetta con la soluzione di pipetta e posizionarla nel supporto della pipetta. Portare la pipetta nella soluzione da bagno con un micromanipolatore e spostarla appena sopra il mitoplasto selezionato per avvicinarsi all'IMM.
Mantenere il potenziale di membrana a zero millivolt e applicare impulsi di 10 millivolt utilizzando il comando di test della membrana nel programma dell'amplificatore. Applicare una leggera pressione negativa per creare rapidamente un gigaseal con l'IMM. Sollevare la pipetta con il mitoplasto attaccato per tenerli lontani dallo slittamento del coperchio per evitare la rottura della guarnizione dovuta alla deriva della pipetta durante l'esperimento.
Compensare i transitori di capacità vagante con il comando di test della membrana nel programma dell'amplificatore prima di testare la configurazione dell'intero mitoplasto per ottenere una corretta misurazione della capacità per la membrana del mitoplasto dopo l'irruzione. Applicare impulsi di tensione di breve durata con il programma amplificatore per rompere la patch di membrana sotto la pipetta di vetro e ottenere l'intera configurazione mitoplasto. Dopo l'effrazione, montare i transitori di capacità con l'opzione di test a membrana del programma amplificatore per valutare la capacità della membrana e la sua resistenza di accesso.
Immediatamente dopo l'effrazione, sostituire la soluzione di bagno di cloruro di potassio con una soluzione da bagno HEPES tramite perfusione. Applicare un protocollo di rampa di 850 millisecondi con il programma dell'amplificatore. L'applicazione del protocollo di rampa di tensione induce una corrente protonica di grande ampiezza attraverso l'IMM di grasso bruno senza l'aggiunta di acidi grassi esogeni, gli attivatori richiesti delle OCP.
Dopo la perfusione da parte dell'inibitore UCP1 guanosina difosfato o della metil beta ciclodestrina 10 millimolare per l'estrazione di acidi grassi di membrana endogena, la corrente residua viene utilizzata per determinare l'ampiezza delle correnti UCP1, che scompare completamente nell'IMM dei topi carenti di UCP1. A differenza del grasso bruno, l'IMM dei tessuti non adiposi, come il muscolo scheletrico e il cuore, non sviluppa una corrente protonica misurabile immediatamente dopo l'irruzione. Per indurre una corrente protonica misurabile attraverso l'AAC, è essenziale applicare la soluzione bagno hepes contenente da uno a due micromolari di acidi grassi esogeni.
Per confermare che la corrente protonica misurata è trasportata da AAC, è importante applicare inibitori specifici, carbossiatractiloside, che inibiscono quasi completamente la corrente protonica mostrata nell'IMM di topi carenti di AAC1. Un'inibizione costante ma mai completa della perdita di protoni si ottiene solo quando l'ADP è presente su entrambi i lati della membrana per generare uno scambio nucleotidico attivo tramite AAC. La qualità della preparazione del mitoplasto influenzerà il tasso di successo nel raggiungimento della configurazione dell'intero mitoplasto.
È essenziale ottimizzarlo. Una volta sezionato il meccanismo molecolare della termogenesi mitocondriale con la tecnica del patch clamp, la misurazione del consumo di ossigeno mitocondriale dimostrerà l'importanza della corrente protonica e della termogenesi nei mitocondri intatti. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori per esplorare tutti i tipi di conduttanza, ioni e metaboliti importanti per il funzionamento dei mitocondri.
