Questo metodo di isolamento delle cellule endoteliali retiniche consentirà tecniche avanzate di sequenziamento per rivelare nuovi meccanismi di sviluppo vascolare. Il protocollo descritto è ottimizzato per elevati gradi di vitalità e purezza, che sono essenziali per le applicazioni di sequenziamento di prossima generazione. A dimostrare la procedura sarà Shelby Cain, uno studente laureato del laboratorio Hershey.
Inizia a rimuovere gli occhi dal topo neonatale eutanasia tagliando via la pelle e la membrana sopra l'occhio con un'incisione perpendicolare alla palpebra usando le forbici da dissezione. Quindi utilizzare la pinza per premere verso il basso sopra e sotto l'occhio in modo che l'occhio si sposti fuori dalla presa. Pizzicare delicatamente sotto l'occhio con la pinza e tagliare il nervo ottico che mantiene l'occhio attaccato.
Quindi posizionare entrambi gli occhi del topo in un pozzetto della piastra a 48 pozzetti nel PBS ghiacciato appena preparato fino al termine della raccolta. Per isolare il tessuto retinico del topo, sospendere gli occhi nel tampone di dissezione in una capsula di Petri riempita con 500 microlitri di PBS ghiacciato utilizzando un tampone per tubi di trasferimento con una punta larga. Lavorando al microscopio a dissezione, tenere il nervo ottico con una pinza fine e utilizzare la seconda pinza per perforare il foro attraverso la camera anteriore dell'occhio dove si collegano la cornea e la sclera.
Quindi strappare il foro in un cerchio circa il 75% del percorso intorno alla cornea. Mentre si tiene il nervo ottico con una pinza, utilizzare la seconda pinza per strappare delicatamente la sclera e il corpo vitreo dal tessuto retinico. Per rimuovere la lente e i vasi del plesso ialoide, raggiungere la retina con una pinza aperta fino quasi a toccarla e quindi chiudere la pinza per afferrare e tirare la lente e i vasi del plesso ialoide fuori dalla retina.
Quando tutti i vasi vengono rimossi, posizionare le retine nei tubi di micro-centrifuga da due millilitri riempiti con 500 microlitri di un PBS ghiacciato. Rimuovere il PBS in eccesso dal tubo di microcentrifuga da due millilitri con una pipetta lasciando circa 100 microlitri di PBS nel tubo per coprire completamente il tessuto retinico. Quindi aggiungere 500 microlitri della soluzione di digestione appena preparata al tubo.
Utilizzare una pipetta P1000 e una punta di pipetta per pipettare su e giù per il tessuto retinico nella soluzione di digestione cinque volte. Al termine, incubare la miscela di digestione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 20 minuti con pipettaggio della miscela di digestione su e giù ogni cinque minuti come spiegato prima. Dopo l'incubazione, il tessuto retinico si dissolverà in una sospensione a singola cellula rendendo la miscela di digestione torbida.
Quindi, pellettare le celle mediante centrifugazione a 375 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, rimuovere il PBS dal pellet cellulare lavato mediante pipettaggio e quindi immunocolorare le cellule risospendendo il pellet in 100 microlitri di soluzione anticorpale per 0,5 volte 10 alle sesta celle. Incubare la sospensione monocellulare con la soluzione anticorpale per 30 minuti sul ghiaccio al buio picchiettando il tubo ogni 10 minuti per mescolare delicatamente le cellule.
Per la selezione delle cellule attivata dalla fluorescenza, pellettare le celle mediante centrifugazione a 375 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso il surnatante, lavare e pellettare le cellule in 500 microlitri di PBS come descritto in precedenza. E poi risospendere le cellule in 300 microlitri di selezione cellulare attivata dalla fluorescenza o tampone FACS mescolando delicatamente con la pipetta.
Successivamente, aggiungere ioduro di propidio o PI come marcatore di vitalità alle provette contenenti il tampone FACS per ottenere una concentrazione finale di 0,5 microgrammi per millilitro. Utilizzare una pipetta per trasferire le sospensioni cellulari attraverso un tappo a scatto contenente un filtro da 35 micron in una provetta da cinque millilitri. Dopo la filtrazione, tenere il tubo FACS sul ghiaccio al buio e quindi trasferire il tubo nella selezionatrice cellulare.
Accendere lo strumento FACS e il computer e aprire il software FACS per eseguire e utilizzare lo strumento FACS. Eseguire test di controllo qualità di routine. Caricare i campioni di macchie di controllo nello strumento FACS per regolare gli assi.
Inizia con le cellule solo anticorpali IgG per generare e regolare la dispersione in avanti e la dispersione laterale. Quindi l'anticorpo CD31 solo per generare e regolare CD31. E poi l'anticorpo CD45 solo per generare e regolare CD45.
Registrare i dati dai campioni di controllo. Quindi, caricare le celle del campione colorato nello strumento FACS ed eseguire il campione. Andare le celle in base ai parametri di forward scatter o FSC e side scatter o SSC.
Cellule del cammino di FSCA e FSCH per identificare i doppietti cellulari e raccogliere solo singole cellule. Cellule dell'andatura mediante PI e SSCA per identificare le cellule vitali. Crea un'andatura CD31 + CD45 con controlli Crea un'andatura CD31 + CD45 con controlli e andatura le cellule con CD31 e CD45.
Inserire un tubo di raccolta con 250 microlitri di tampone FACS nello strumento. Quindi, iniziare a ordinare le celle CD31 + CD45 nel tubo di raccolta installato. Tenere i tubi di raccolta sul ghiaccio per ulteriori analisi.
I campioni possono essere elaborati per applicazioni di sequenziamento di nuova generazione. Nello studio, la variazione del tempo di digestione ha influenzato la resa cellulare e la percentuale di vitalità. Il tempo di digestione di 20 minuti ha portato a una resa ottimale con una bassa percentuale di cellule endoteliali non vitali.
La successiva colorazione con ioduro di propidio ha dimostrato che le cellule endoteliali isolate sono rimaste vitali per 60 minuti dopo l'isolamento. La purezza della popolazione cellulare è stata valutata mediante analisi quantitativa PCR o qPCRR dell'espressione dei geni delle cellule endoteliali che mostrano un forte arricchimento per i geni delle cellule endoteliali nella popolazione CD31 + CD45. Purificare l'RNA dalle cellule endoteliali isolate convertendo e amplificando il cDNA attraverso la preparazione e il sequenziamento della libreria La libreria di cDNA ha portato a più di 16.000 geni identificati in nove campioni indipendenti.
Un calo delle trascrizioni per milione di letture o TPM è stato osservato nei geni al di sotto di questa soglia. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula delle cellule endoteliali retiniche isolate attraverso la pipeline 10x Genomics ha portato a una mediana di 1.171 geni per cellula, 15.247 geni totali rilevati e una mediana di 2.255 identificatori molecolari univoci o conteggi UMI per cellula in 917 cellule. I passaggi critici di questo protocollo sono l'isolamento del tessuto retinico e la digestione dei tessuti, che devono essere eseguiti accuratamente come descritto per ottimizzare la resa e la vitalità cellulare.
Le cellule endoteliali isolate possono essere utilizzate in tecniche di sequenziamento avanzate come il sequenziamento dell'RNA dell'intero trascrittoma, il sequenziamento dell'RNA a singola cellula, il sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina e il saggio per il sequenziamento della cromatina accessibile alla trasposasi. L'uso di questo metodo ottimizzato in combinazione con metodi di sequenziamento di nuova generazione e approcci computazionali può chiarire ulteriormente i meccanismi delle vie di segnalazione interconnesse che regolano gli sviluppi vascolari.
