1分子イメージングは、デュアルビーム光ピンセットと共焦点顕微鏡を組み合わせて、商業的なセットアップで実施します。ビーズのトラップにはチャネル1を、DNAタンパク質複合体の結合にはチャネル2を、CMGの存在を確認するにはチャネル3を、タンパク質リザーバーとバッファー交換位置としてチャネル4と5を注入します。注入ポートで0.5 barの一定圧力ですべての溶液をフローセルに流します。
次に、チャネル 4 と 5 の流れをオフにします。最初にすべての溶液を流した後、圧力を0.2バールに下げます。トラップレーザーをチャネル1に移動させ、各光トラップに1つのビーズが引っかかるまで動かします。
トリガーを押しながらジョイスティックを動かして、トラップされたビーズをチャネル2に移動します。トリガーを押さずにジョイスティックを使用して、DNAテザーがトラップされるまで、右のビーズを左のビーズに近づけたり離したりすることで、DNA CMG複合体をフィッシュします。ビーズをチャネル3に移動し、すべてのチャネルで流れを直ちに停止します。
励起レーザーパネルで561ナノメートルのレーザー出力を4マイクロワットに調整し、チャネル3でDNAの1フレームテストスキャンを行います。存在する場合、CMG は 2 次元回折限定スポットとして表示されます。この場合、DNAテザーをチャネル4または5に移動してイメージングします。
それ以外の場合は、フローをオンに戻し、ビーズを捨てて手順を繰り返します。チャンネル4または5で、フォース分光パネルに2つのピコニュートンを入力し、イネーブルボタンをクリックしてフォースクランプを開始します。初期張力が2ピコニュートンに達したら、フォース分光パネルのイネーブルボタンを再度クリックして、イメージング前にフォースクランプを無効にします。
イメージスキャンパネルのスキャン開始ボタンをクリックします。対物レンズで測定された4マイクロワットの出力で561ナノメートルレーザーを使用して、5秒ごとに蛍光CMGを画像化します。凝集のない反応では、CMGはDNAにまばらに密集した離散的で対称的な回折限定スポットとして現れました。
それどころか、凝集体は離散性が低く、時には非対称の塊がDNAのより長い長さに密集しています。アッセイが成功裏に実施され、精製されたタンパク質の高純度が達成された場合、ATPの存在下でのCMGの長距離運動が観察される可能性があります。
