私たちは、批判的に原稿を読み取るためのジェームズ·ウォーターズ、ゲーブルワズワースとボーブロードウォーターに感謝します。我々はまた、有益なコメントを提供するための4の匿名査読に感謝します。私たちは、ジョージア工科大学、科学的なインタフェースでバローズWellcomeの基金のキャリア賞、生物系のNSFの物理学の学生の研究ネットワークの助成金からの財政支援を認める。

1。二本鎖DNAサンプル調製<ol><li>デザインは、全体的に10マー配列を繰り返すことによりDNAを湾曲。例えば、5&#39;-GTGCCAGCAACAGATAGC - （TTTATCATCCTTTATCATCC X）7 - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 &#39;は、Xがランダム余分な塩基であり、繰り返し10量体配列に隣接する配列は、アダプター配列で186 bpの湾曲したDNAである。 注：カプランらによる大規模なヌクレオソーム占有研究に基づいてヌクレオソームの形成とは逆の好みにこの例では、2つの10量体15が選ばれた。二本鎖DNAの螺旋の繰り返しが10塩基対に近いので、10 -マーの螺旋軸のいずれかの正味たわみは円弧（ 図3A）のような形状を生成するために蓄積されます。ヘリカル期間は10.5 BPに近いので、余分な塩基が可能な平面として湾曲した構造を維持するために、すべての2の繰り返しの後に挿入されます。 200 BPより短いこれらの配列は、companieのから注文することができます遺伝子合成サービスを提供していますS。これは、後続のステップのための共通のアダプター配列をこれらの配列に隣接するのが便利である。手順を図3Bに図式化されている。 </li><li>プライマー1（GTGCCAGCAACAGATAGC）及びプライマー2（/ 5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG）を用いてPCRを行う。 NOTE：プライマー2は、その5 &#39;末端にFRETドナーCy3で標識される。典型的なPCRレシピやサイクリングプロトコルは、 表1および表2に示す。 </li><li>プライマー3（/ 5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC）及びプライマー4（CAACAACGAGCTCGAATG）を用いてPCRを行う。 NOTE：プライマー3を5 &#39;末端に骨格とビオチン - リンカーを介してFRETアクセプターCy5で標識される。 PCRのレシピ、サイクリングプロトコルは、上記の通りである。 </li><li> PCRクリーンアップキットを用いてPCR産物を精製する。 </li><li> 0.4＆最終濃度鎖交換用緩衝液（100mMのNaCl、10mMのトリス-HCl、pH7.0、1mMのEDTA）中のCy​​3標識産物およびCy5標識生成物を混合しそれぞれMと0.1μM;＃181。注：過剰のCy3-DNAは、鎖交換の結果として、Cy3およびCy5の両方を運ぶ二重鎖の濃度が増加します。 </li><li>徐々に5まで冷却し、2分間98.5℃でインキュベートすることにより為替ストランド ランプ0.1°C /秒の速度、および5でのインキュベーションと°C &#160; 2時間Cと°。 </li></ol> 2。ゲル電気泳動は、二本鎖DNAの曲率を検出するための<ol><li> 29.2:0.8の割合でアクリルアミドとビスアクリルアミドの溶液を混合することによりポリアクリルアミドゲル16,17を注ぎ、5％（w / v）のpH8.0の1Xトリス/ボレート/ EDTA（TBE）緩衝液中。注：ゲル溶液10mlを含有する：1.217ミリリットルの40％アクリルアミド、0.667ミリリットルの2％ビス-アクリルアミドを1ml TBE 10Xを、100 Lの過硫酸アンモニウム（APS）10％、10 L TEMED、残りはをdH 2 Oである。ゲルの全固体化には約30分かかります。 </li><li> DNA試料および1Xローディング緩衝液中のDNAラダー（5％グリセロール、0.03％（w / v）のブロモフェノールblを用いてポリアクリルアミドゲルをロードするUE）と45分間、又は染料前線がゲルの端に近づくまで4℃で5-8 V / cmとゲルを実行する。 </li><li> 30分間、0.5μg/ mlの臭化エチジウムを含有する1X TBE緩衝液を用いてゲルを染色する。 UV照射下でDNAバンドを識別します。 DNA分子の見かけの大きさを計算するためにサイズマーカー（100 bpのDNAラダー）を用いてバンドの位置を比較する。注：湾曲したDNAは、ほぼ直線状のDNAよりも遅く移動する。 </li></ol> 3。細胞調製フロー<ol><li>ドリルドリルプレス、ダイヤモンドドリルビットを用いてガラススライドの二つの対向するエッジ（3×1&#39;&#39;&#39;&#39;）に沿った正孔の対6-7。掘削した後、目に見えるガラス粉末を除去するために水を流すことでスライドをこする。 NOTE：穴は、灌流入口及び出口として機能する。掘削時には、水でスライドを冷却して割れを防ぐことが重要です。 </li><li>ガラスジャーに直立スライドを置き、水でそれを埋める。 15分間超音波処理し、別のガラスジャードにそれらを転送アセトン洗浄にdicated。 15分間のアセトンと超音波処理でそれを埋める。スプレーボトルを使用してエタノールでスライドを洗い流してから水と。 、ポリプロピレンジャーに配置し、5Mの水酸化カリウムとそれを記入し、15分間超音波処理。最後に、15分間水中でスライドを超音波処理する。同じプロトコルを使用してカバーグラス（1号、24×40 mm）を清掃してください。 NOTE：クリーンスライドとカバースリップは、長期間の使用のためのdH 2 Oに保存することができる。 </li><li> 0.1 M重炭酸ナトリウム溶液の340 LでのmPEG-シラン（MW 2000）の80 mgのビオチン-PEG-シラン（MW 3400）1mgを混合する。よく混ぜ、気泡を取り除くために簡単に混合し遠心する。注：ポリエチレングリコール（PEG）で表面の機能化は、表面へのDNAの非特異的結合を減らすことができます。 </li><li>各スライド上のPEG溶液80 Lを入れて、ゆっくりとその上にカバースリップを下げる。 45分間待ちます。 、ピンセットでスライドからカバーガラスを分離するのdH 2 Oを多量のでそれらを洗い流しとletトンオープンエアでの裾ドライ。 </li><li>チャネルを形成するスライド全体に両面テープの薄いストリップを配置します。その上にカバーガラスを合わせ、しっかりと液密チャネルを形成するスライドに対してカバースリップを押してください。チャンネルのエッジをシールするために5分エポキシを使用してください。 </li></ol> 4。トロロックス溶液の調製を<ol><li>フラスコの中で〜30mgのトロロックスと10ミリリットルのdH 2 Oを入れて、18時間オープンエアでソリューションを攪拌し、マグネット攪拌棒を使用しています。 </li><li> 0.2μmのフィルターを用いて溶液を濾過し、1Mトリス塩基（pHが11）の〜6μLを加えることによりpHを7に調整。注意：トロロックスは、単一分子は18の研究で一般的に使用されている抗点滅試薬である。トロロックスの褪色防止作用は、部分的に分解ロックス液19中に存在し、その酸化誘導体から来ている。すぐにメタノールや高pH Tris溶液中トロロックスを溶解しているため、非効率的酸化のは避けるべきである。 </li></ol> 5。シングルモルeculeイメージング<ol><li>チャンネルにニュートラ溶液（0.5 mg / ml）を15μlのを注入し、T50緩衝液100μl（10mMトリス-HCl、50mMのNaCl、pH7.0）でリンスする前に、2分間待ちます。 </li><li>チャネルにDNAサンプル（50〜PM）の50μLを注入。 5分間待ってから、T50バッファの100リットルで、未結合するDNAを洗い流す。 NOTE：DNA分子が特異的にニュートラアビジン - ビオチン相互作用を介して表面に結合する。 </li><li>酸素除去システム20（100 mMのPCD、5 mMのPCA、1 mMのトロロックス、および500のNaCl）が含まれているイメージングバッファーでチャンネルを入力します。 </li><li>毎秒25フレームの速度でパソコンに2×2ビニングされた画像（256×256）をストリーミングするために、フレーム転送モードでEMCCDを設定します。 </li><li>顕微鏡対物レンズにイマージョンオイルを入れて、試験片のクリップを使用して、顕微鏡ステージ上でフローセルを修正。壁にレーザー反射パターンを見ることで、フォーカスを粗調整します。蛍光IMのライブビューを使ってピントを微調整モニター上の年齢層。 </li><li>上の532 nmのレーザーを使用してデータ収集を開始します。ライブビューを確認し、必要に応じてフォーカスを調整します。ほとんどの分子が退色している​​時にデータ収集を停止します。 注：この機能では、顕微鏡を制御し、これらはハードディスクに保存されるようにモニターにライブ映像を表示するためのラボが作成したCプログラムが使用されます。 </li></ol> 6。画像処理とデータ解析 NOTE：256×256画像の時系列を、Cy3およびCy5強度の単一分子タイムトレースを生成するために、MATLABコードによって処理される。ドナーチャネルとスプリットビュー画像の受容チャネル​​との間のピクセルを対にする、Cy3およびCy5スポットの6-7組、均等に視野に分散し、同じ分子からの各ペアは、アフィン変換を手動で拾い、アールアンカーポイントとしてこれらのスポットの座標を用いて計算される。 <ol><li> MATLABスクリプトを使用して、すべての単一分子の時間に目を通すトンをトレース帽子は高低のFRETシグナルの間に複数の遷移を示しています。ループ状にループしない状態を識別します。 NOTE：FRET信号（I a）は、Cy3およびCy5強度（I dはI +）との和で割ったCy5の強度として定義される。ループしない状態が低いFRET値を有しながらループ状態が高いFRET値を有する。単一分子からのFRETシグナルのヒストグラムが二峰性のため、可逆ループしunlooping分散されている。 </li><li> 2フィットガウス曲線との交点を決定することにより、二つの分布を分離しきい値を検索します。 </li><li> FRET効率などを計算する<img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq7.jpg" />と高いFRET値と低いのFRET値がループしない状態でループ状態を割り当てます。 </li><li> MATLABスクリプトを使用して、分子（N（t））との累積数を分析することは、ループ（またはデータ収集の開始から異なる時間が経過においてFRETハイ状態）に達した。注：二本鎖DNA分子は、データ収集の開始時にループしない状態のいずれかのコンフォメーションで起動することができますので、ループの人口の増加率は平均ルーピング率は初期のコンフォメーションで平均化が反映されます。指数関数で、N（t）を当てはめることによって、ループ速度k ループを抽出します。 <img fo:content-width="1.8in" src="/files/ftp_upload/51667/eq1.jpg" />二相性が増加すると、二重指数関数を取り付けることができる。 <img fo:content-width="2.2in" src="/files/ftp_upload/51667/eq2.jpg" />この場合、k個のループはから得られる。 <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51667/eq3.jpg" />注：理論的には、ポリマーは時刻tにループしていないことを生存確率は、単一または二重の指数関数12ではありません。指数関数的なFITTING平均ループ時間を抽出するための実用的な手段として使用される。 </li></ol> 7。、J係数を決定 NOTE：J係数はdsDNAの一端が他端の周囲にどのように濃縮表す。これは、測定された速度ループなどの他の端部セグメントと同じ反応速度を産生するDNAの一方の端部セグメントの濃度を補間することによって決定することができる。実験的には、一方の端部セグメントが表面上に固定され、他方の端部セグメントは、特定の濃度cで導入される。両端の測定されたアニール速度がk アニールである場合、J因子21は次式で与えられる。 <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq4.jpg" /> 。アニール速度定数（k = kのアニールアニール / C）は、プローブ濃度とは無関係である。 <ol><li> 30〜50 pMのビオチン-Cy5のオリゴの20μL（プライマー3）を流れ、IニュートラコートされたチャネルNTO。未結合のオリゴを洗い流すために、100μlのT50とのチャネルを洗浄します。 </li><li> 50nMの最終濃度のCy3オリゴ（プライマー2）を添加した部分5に記載のように撮像緩衝液を調製する。チャンネルにこの画像バッファフロー。 </li><li>上の532 nmのレーザーを維持しながら、簡単に表面に結合したCy5のオリゴの位置を識別するために640 nmのレーザーをオンにします。 640 nmのレーザーをオフにして、FRETシグナルの監視を開始。 注：表面に結合したCy5のオリゴへのCy3オリゴのハイブリダイゼーションの際、Cy5の蛍光は、FRETから発生します。 </li><li> MATLABスクリプトを使用して、結合していない状態（低Cy5の強度）で起動が、後にCy5の強度トレースから時間の関数としてアニールした状態（高Cy5の強度）に変わる分子の数を分析する。 </li><li>アニールされた分子対時間のこの数をプロットします。 （単一指数関数でこの曲線にフィット<img fo:content-width="1.8in" src="/files/ftp_upload/51667/eq5.jpg"/&gt;）アニーリング速度（k アニール ） を得た。 </li><li>アニール速度と反応物濃度との間の直線性を確認するために、さまざまなCy3のオリゴ濃度（60、100、および180 nm）のこの実験を繰り返します。二次アニール速度定数（k アニールを抽出する ）の傾きから。 </li><li> Jからの係数を計算する<img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq6.jpg" /> k個のループは同じ緩衝液条件で測定ループレートである。 </li></ol>

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著者らは、利害の衝突を宣言していません。

FRETに基づく単純な単一分子アッセイは、異なる固有形状のDNAのループ動態を研究するために使用した。湾曲DNAは10.5塩基の螺旋周期と同位相で10マー配列を繰り返すことにより調製することができ、それらの曲率は、PAGEを用いて推定することができる。これらdsDNAs過渡ループの安定化を可能にするように粘着末端を有するように設計されている。私たちは、時間をかけてループされる分子の?...

dsDNAの機械的性質を理解することは、基礎科学や工学アプリケーションで基本的に重要である。連続した塩基対間のロール、チルト、およびねじれ角がシーケンスで変化することができるので、二本鎖DNAの構造はストレートヘリカル梯子よりも複雑です。熱揺らぎは、二本鎖DNAは、曲げねじれやストレッチングなどの立体配座の変動の多様なモードを受ける可能性があります。このような溶融やねじれなどの遷移はまた、極端な条件で発生する可能性があります。 これらの動きの中では、二本鎖DNA曲がりが最も顕著な生物学的影響は1を持っています。二本鎖DNAの曲がりは互いに近接2遠隔部位にすることによって遺伝子抑制または活性化に関連している。それはまた、細胞核又はウイルスキャプシドの内側DNAパッケージングにおいて重要な役割を果たしている。 dsDNAの曲げ変形は、高解像度顕微鏡（AFM及びTEM 2 3）、およびthermodynにより実験的に可視化することができるamics及び動力学は、化学的にdsDNAの並置部位をリンクループアッセイによって研究することができる。 1つのそのようなアッセイはリガーゼ依存環化4である。このアッセイでは、「スティッキー」（凝集）末端を有する二本鎖DNA分子は、DNAリガーゼにより環状又は二量体化される。サークル及び二量体形成の速度を比較することによって、J因子として知られている他端の近傍のDNAの一端の有効モル濃度を得ることができる。このJ係数は、​​他端から短い距離でDNAの一端を見出す確率密度と寸法的に等価であり、したがって、DNAの柔軟性を反​​映する。 DNAの長さの関数としてのJ係数を測定することは持続長4,5含むDNA力学に関する多くの特性を明らかにする。 ワームのようなチェーン（WLC）のモデルが広くexplaでの成功に基づいて二本鎖DNA力学の正規ポリマーモデルと見なされてきた力伸長曲線ining実験6を引いたDNAで得られ、かつ正確に、より長い200塩基対7よりdsDNAsのJ要因を予測する。しかし、100bpのできるだけ短い二本鎖DNA分子上の環化アッセイを用いて、クルーティエとWidomは、WLCのモデル予測8よりも桁違いに高くなるようにJ因子を測定した。一年後、ドゥら 。リガーゼの低い濃度で環化アッセイを使用してWLCモデルと一致J因子を生産し、Widomグループから9リガーゼを使用する高濃度に異常な結果に起因。従来のアッセイ9を使用する場合、この論争が環化速度に及ぼすDNAリガーゼの不可避の影響を例示する。また、DNAリガーゼはまた、非特異的な結合10,11を介してDNA構造および剛性に影響を与えることができる。 タンパク質依存ループアッセイの技術的な問題を解消するために、我々は最近、PROTが実証蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）12に基づいてEINのないループアッセイ。この方法では、ループのコンフォメーションは、DNA分子の付着末端付近に取り付けられたドナーとアクセプターの間のFRETにより検出される。対物レンズ型全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）は、可逆ループと、長期間にわたって表面固定単一DNA分子からunloopingイベントの軌跡を記録するために使用される。この方法は、Vafabakhshとハ13による同様の方法上の重要な改良で、ミスマッチのないDNA分子を生成するために、DNA分子のPCRベースのアセンブリを提供しています。このプロトコルの単一分子の態様は、FRETの態様であってもリガーゼ活性を損なう可能な条件では、1つは、同じ分子から繰り返しDNAのループダイナミクスを測定することを可能にしながら平均をアンサンブルに加えて分布の測定を可能にする。 TIRFMのセットアップを図1に示す。カスタム設計された試料ステージは、オリンパスIX61顕微鏡本体上に配置される。 532 nmおよび640 nmのレーザーは、側面から導入され、カバーガラス-水界面における臨界入射角を達成するために、高NA対物レンズ内に微小な楕円鏡14で反射される。私たちは、より広範なダイクロイックミラーやプリズムベースのTIR設定を行うスルー客観TIRもこのFRET用途に使用できることに注意してください。顕微鏡によって形成された蛍光像は、ダイクロイックミラーによりドナーとアクセプターのイメージに分割される。そして、彼らはEMCCDの両半分に再度結像される。追加のロングパス放出フィルタは、バックグラウンドシグナルを減少させるために使用される。 温度制御は、再現性の速度論的データを取得するために不可欠である。温度制御のために、目的は、熱伝達を最小にするために、顕微鏡本体のノーズピースから分離され、温度制御された冷却器/加熱器からの水が密に嵌真鍮カラーを通って循環される客観的なジャケットの下にあるインテリア金属の周り。このセットアップでは、15〜50°C（ 図2）との間のカバーガラス表面に強固な温度制御を達成することができる。本研究では、試料温度を24℃に維持した。 以下のプロトコルは、DNAの構築、DNA形状の推定、単一分子実験、およびJ要因判定するためのステップバイステップ手順を提示する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="793">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Small DNA FRAG Extract Kit-100PR</td>
			<td style="width:124px;">VWR</td>
			<td style="width:135px;">97060-558</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Acrylamide 40% solution 500 mL</td>
			<td style="width:124px;">VWR</td>
			<td style="width:135px;">97064-522</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 mL</td>
			<td style="width:124px;">VWR</td>
			<td style="width:135px;">97063-948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1000 bp</td>
			<td style="width:124px;">Fermentas</td>
			<td>SM0241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Mini Vertical PAGE System</td>
			<td style="width:124px;">VWR</td>
			<td style="width:135px;">89032-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Syringe filter 0.2um CS50</td>
			<td style="width:124px;">VWR</td>
			<td style="width:135px;">A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Trolox</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">238813-1G</td>
			<td>triplet state quencher</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Protocatechuic acid (PCA)</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">08992-50MG</td>
			<td>oxygen scavenging system</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD)</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">P8279-25UN</td>
			<td>oxygen scavenging system</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">mPEG-silane, MW 2000 1g</td>
			<td style="width:124px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:135px;">MPEG-SIL-2000-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Biotin-PEG-Silane, MW 3400</td>
			<td style="width:124px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:135px;">Biotin-PEG-SIL-3400-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:124px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:135px;">F-540L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB47020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Premium plain glass microscope slides</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">12-544-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">VWR micro cover glass, rectangular, no. 1</td>
			<td style="width:124px;">VWR</td>
			<td style="width:135px;">48404-456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Fisher Scientific Isotemp 1006s Recirculating Chiller/Heater</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>temperature control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Objective Cooling Collar</td>
			<td style="width:124px;">Bioptechs</td>
			<td style="width:135px;">150303</td>
			<td>temperature control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage</td>
			<td style="width:124px;">Semprex</td>
			<td style="width:135px;">KMI53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">High Performance DPSS Laser 532nm 50mW&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Edmund optics</td>
			<td style="width:135px;">NT66-968</td>
			<td>Cy3 excitation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:351px;">CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30mW, Fiber, FC/APC Connector</td>
			<td style="width:124px;">Coherent</td>
			<td style="width:135px;">1139604</td>
			<td>Cy5 excitation</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter</td>
			<td style="width:124px;">Semrock</td>
			<td style="width:135px;">FF650-Di01-25x36</td>
			<td>splitting dichroic</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:351px;">LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, &#38; 543.5 nm lasers, 25 mm</td>
			<td style="width:124px;">Semrock</td>
			<td style="width:135px;">LM01-552-25</td>
			<td>combining dichroic</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Brightline Fluorescence Filter 593/40</td>
			<td style="width:124px;">Semrock</td>
			<td>FF01-593/40-25</td>
			<td>Cy3 emission filter</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm</td>
			<td style="width:124px;">Semrock</td>
			<td style="width:135px;">BLP01-635R-25</td>
			<td>Cy5 emission filter</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">EMCCD iXon+</td>
			<td style="width:124px;">Andor Technology</td>
			<td style="width:135px;">DU-897E-CS0-#BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">IX51 inverted microscope frame</td>
			<td style="width:124px;">Olympus</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Objective UApo N 100x/1.49 Oil TIRF</td>
			<td style="width:124px;">Olympus</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Immersion oil type-F for fluorescence microscopy</td>
			<td style="width:124px;">Olympus</td>
			<td style="width:135px;">IMMOIL-F30CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">2mm Diameter 45&#176; Rod Lens Aluminum Coated&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Edmund optics</td>
			<td style="width:135px;">54-092</td>
			<td>miniature mirror</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1/4&#34; Travel Single-Axis Translation Stage</td>
			<td style="width:124px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:135px;">MS-1</td>
			<td>translation of miniature mirror</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">&#216;1&#34; Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm</td>
			<td style="width:124px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:135px;">AC254-200-A</td>
			<td>focusing lens</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Adjustable Mechanical Slit</td>
			<td style="width:124px;">Thorlabs</td>
			<td>VA100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Dielectric Mirror</td>
			<td style="width:124px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:135px;">BB1-E02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">&#216;1&#34; Achromatic Doublet, f = 100 mm</td>
			<td style="width:124px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:135px;">AC254-100-A</td>
			<td>relay lens</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Lens Mount for &#216;1&#34; Optics</td>
			<td style="width:124px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:135px;">LMR1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Dichroic Filter Mount</td>
			<td style="width:124px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:135px;">FFM1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Fixed Cage Cube Platform</td>
			<td style="width:124px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:135px;">B3C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Kinematic Mount for &#216;1&#34; Optics</td>
			<td style="width:124px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:135px;">KM100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">N-BK7 Plano-Convex Lens, &#216;1&#34;, f = 40 mm</td>
			<td style="width:124px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:135px;">LA1422-A</td>
			<td>collimating lens</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">N-BK7 Plano-Convex Lense, &#216;6.0 mm, f = 15 mm</td>
			<td style="width:124px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:135px;">LA1222-A</td>
			<td>telescope lens</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">N-BK7 Plano-Convex Lense, &#216;6.0 mm, f = 150 mm</td>
			<td style="width:124px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:135px;">LA1433-A</td>
			<td>telescope lens</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying dna looping by single-molecule fret

二本鎖DNA（dsDNA）の屈曲は、ヌクレオソーム内に、例えばDNA-タンパク質認識およびDNAのパッケージングのような多くの重要な生物学的プロセスに関連している。二本鎖DNAの曲げの熱力学は、共有結合dsDNAの短い付着末端を結合するDNAリガーゼに依存している環化と呼ばれる方法で研究されている。しかし、ライゲーション効率は、そのような接合粘着末端を取り囲むDNA構造としてループdsDNAに関係のない多くの要因によって影響され得る、およびリガーゼはまた、非特異的結合の機構を通じて明らかなループ速度に影響を与えることができる。ここでは、FRET（蛍光共鳴エネルギー移動）による一過性DNAループの形成を検出することによってリガーゼなしでのdsDNAのループ速度を測定する方法を示している。二本鎖DNA分子は、FRET対とビオチンリンカーを有する単純なPCRベースのプロトコルを使用して構築される。 J因子として知られているループする確率密度は2 disconnec間をループレートとアニール速度から抽出されるテッド粘着末端。異なる固有の曲率を有する2つのdsDNAsを試験することによって、我々は、J因子はdsDNAの固有の形状に敏感であることを示している。

ループ試験のために使用されるDNA分子は、可変配列および長さと互いに相補的な一本鎖オーバーハングの二本鎖領域からなる。 7塩基の長さである突出部は、ループ状態をキャプチャするために互いにアニールすることができる。各オーバーハングはダイト化学によりDNA骨格にリンクされているのCy3またはCy5のいずれかが含まれます。 Cy5標識オーバーハングもまた、ビオチン-TEG ​​表面固?...

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Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

この研究は、単一分子蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を用いて二本鎖DNAのループダイナミクスを測定するための詳細な実験手順を提示する。プロトコルは、Jファクターと呼ばれるループする確率密度を抽出する方法を説明します。

1分子FRETによるDNAループを研究

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

studying-dna-looping-by-single-molecule-fret

Research

JoVE Journal

Biology

15.3K ビュー.  Georgia Institute of Technology. この研究は、単一分子蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を用いて二本鎖DNAのループダイナミクスを測定するための詳細な実験手順を提示する。プロトコルは、Jファクターと呼ばれるループする確率密度を抽出する方法を説明します。 

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Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

二層弾性特性の変化をモニタリングするための単一分子法

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

生物学

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically functional inside the cell, nucleic acid-based therapeutics require an efficient intracellular delivery system. One widely adopted approach is to complex DNA with a gene carrier to form nanocomplexes via electrostatic self-assembly, facilitating cellular uptake of DNA while protecting it against degradation. The challenge lies in the rational design of efficient gene carriers, since premature dissociation or overly stable binding would be detrimental to the cellular uptake and therapeutic efficacy. Nanocomplexes synthesized by bulk mixing showed a diverse range of intracellular unpacking and trafficking behavior, which was attributed to the heterogeneity in size and stability of nanocomplexes. Such heterogeneity hinders the accurate assessment of the self-assembly kinetics and adds to the difficulty in correlating their physical properties to transfection efficiencies or bioactivities. We present a novel convergence of nanophotonics (i.e. QD-FRET) and microfluidics to characterize the real-time kinetics of the nanocomplex self-assembly under laminar flow. QD-FRET provides a highly sensitive indication of the onset of molecular interactions and quantitative measure throughout the synthesis process, whereas microfluidics offers a well-controlled microenvironment to spatially analyze the process with high temporal resolution (~milliseconds). For the model system of polymeric nanocomplexes, two distinct stages in the self-assembly process were captured by this analytic platform. The kinetic aspect of the self-assembly process obtained at the microscale would be particularly valuable for microreactor-based reactions which are relevant to many micro- and nano-scale applications. Further, nanocomplexes may be customized through proper design of microfludic devices, and the resulting QD-FRET polymeric DNA nanocomplexes could be readily applied for establishing structure-function relationships. 

We present a novel and powerful integration of nanophotonics (QD-FRET) and microfluidics to investigate the formation of polyelectrolyte polyplexes, which is expected to provide better control and synthesis of uniform and customizable polyplexes for future nucleic acid-based therapeutics.

組み合わせるQD - FRETとマイクロ流体はリアルタイムでDNAのNanocomplex自己組織化を監視する

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

蛍光顕微鏡による可視化単分子のDNAの複製

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

表面固定化生体分子の単一分子蛍光測定のための自動化システム

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

アッセイをストレッチ単一分子のDNAを用いて酵素の複製DNAの直接観察

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

核輸送の1分子イメージング

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

FRETはレシオメトリックで細胞周期のキナーゼおよびホスファターゼの活動を監視

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

遺伝子調節の1分子蛍光イメージング<emインビボ&gt;</em&gt;開裂により同時翻訳アクティベーションの使用（CoTrAC）

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

タンパク質-DNA相互作用の研究のための単一分子マニピュレーションとイメージングを組み合わせる

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

三次元ハイドロゲルでイメージングをFRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...