このプロトコルにより、研究者は、疾患に関連する一塩基変異体のこれまで利用できなかった多くのゼブラフィッシュモデルを構築することができます。PAMの制限は正確な動物モデルを作成する上で大きな障害であり、zSpRY-ABE8eは、低い相互変異と緩和されたPAN制限により、効率的なアデニンからグアニンへの塩基変換を可能にします。このツールは、一塩基海兵隊に関連する病原性疾患メカニズムを研究するための正確なゼブラフィッシュモデルの構築、およびこの病気の薬物スクリーニングに使用できます。
まず、マイクロピペットプーラーシステムをセットアップし、少なくとも30分間予熱します。ガラスキャピラリーを引っ張るには、プログラムを選択し、ランプテスト値を熱、50を引っ張り、速度を100、時間を50、圧力を30に設定します。次に、キャピラリーチューブが溝にあることを確認します。
プルスタート/ストップを押してプログラムを実行します。引っ張られた毛細血管を保存するには、針を吊り下げたまま隙間のあるフォームに挿入します。実験には、原稿に記載されているzSpRY-ABE8e mRNAを使用し、両末端を2'O-メチルホスホロチオエートで修飾したsgRNAを簡単に編集します。
gRNAデザインでは、zSpRY-ABE8eはNYN PAMよりもNRN PAMに対する高い選好性を示すため、PAM配列としてNRNを優先的に選択します。 ターゲットアデニンヌクレオチドは、プロトスペーサーに沿って3番目から9番目のヌクレオチドまで高活性編集ウィンドウに入る。注射の前夜に繁殖タンクを設置します。
仕切りを挿入し、各タンクに2匹のメスと1匹のオスのゼブラフィッシュを配置します。各タンクに蓋をします。翌朝、RNaseフリーのチップ、チューブ、手袋を使用して、解凍したmRNAとEEgRNAを氷上で混合し、それぞれマイクロリットルあたり400ナノグラムと200ナノグラムの最終濃度にします。
空気圧マイクロインジェクターを構成するには、まず、エアポンプの分圧バルブを閉じます。次に、メインバルブを開き、ガスボンベのネジを外し、分圧バルブの圧力を0.2メガパスカルに調整します。次に、マイクロインジェクターの電源を入れ、モードをタイマーに設定します。
パラメータ圧力バルブを20ポンド/平方インチに調整し、タイマー値を0.040秒に調整します。細かい鉗子を使用して、実体顕微鏡下で引っ張られたガラス毛細血管の針を角度を付けて壊します。マイクロローダーピペットチップを使用して、mRNA/gRNA混合物をガラスキャピラリーの先端に加え、針をマイクロマニピュレーターに取り付けます。
マイクロキャップを使用して注入ごとに2ナノリットルの混合物を生成するように圧力とタイマーの値を構成します。魚を10〜15分間飼育した後、卵をこしで集めます。実体顕微鏡で細胞の病期と卵の質を調べます。
単細胞卵を注入して編集効率を向上させます。卵を1.5%アガロース注射プレートに並べ、顕微鏡を使用して2ナノリットルのRNA混合物を胚の細胞に注入します。E3バッファーでペトリ皿に卵を集め、摂氏28度でインキュベートします。
死んだ卵を取り除き、受精後48時間、12時間ごとに培養バッファーを交換します。受精後48時間後、ランダムに選択された6つの注入胚の3つのプールをPCRチューブに集めます。無作為に選択された6つの対照胚を採取したら、ピペットを使用して残留E3バッファーを吸引します。
40マイクロリットルの50ミリモル水酸化ナトリウムを胚に加える。チューブを摂氏95度の金属浴に20分間置き、次に15秒間ボルテックスします。pH 8の1モル塩酸トリスを各チューブに4マイクロリットル加えます。
チューブを2000gで室温で10秒間遠心分離します。上清を新しいPCRチューブに移します。PCRチューブから1マイクロリットルの上清を取り除き、サンガーシーケンシングに使用します。
その後、残りの上清を摂氏20度で保管します。サンガーシーケンシングデータを解析するには、まずシーケンシングファイルをアップロードab1 Fileボックスにアップロードします。20塩基対のgRNA配列を5'〜3'方向のgRNA配列を「gRNAを入力」配列ボックスに入力します。
対応するベース位置を 5'開始ボックスと 3'終了ボックスに入力します。予測編集」をクリックし、シーケンスデータの品質を確認することで、基本的な編集効率を取得します。Tsr2の開始コドンのアデニンをグアニンに変換することにより、ダイヤモンドブラックファン貧血ゼブラフィッシュモデルを構築した。
配列データのEditR解析は、Tsr2開始コドンのアデニン塩基におけるAGオーバーラップを示した。2日齢のTsr2胚の表現型は、対照胚と比較してより小さな目を示した。突然変異胚にも心膜の腫れが観察された。
効率的なベース編集を実現するためには、実験を成功させるための前提条件である前述のガイドライン設計原則に厳密に従ってください。正確なモデルは、一塩基変異関連疾患の研究に不可欠です。SprY-ABE8eの開発は、正確なモデリングのための効果的なツールを提供し、疾患メカニズムと治療法の研究を促進するのに役立ちます。
