이 프로토콜을 통해 연구자들은 질병 관련 단일 뉴클레오티드 변이체에 대해 이전에는 사용할 수 없었던 여러 제브라피쉬 모델을 구축할 수 있습니다. PAM 제한은 정확한 동물 모델을 만드는 데 주요 장애물이며, zSpRY-ABE8e는 낮은 순열과 완화된 PAN 제한으로 효율적인 아데닌 염기 전환을 가능하게 합니다. 이 도구는 단일 뉴클레오티드 마린과 관련된 병원성 특성 질병 메커니즘을 연구하기 위한 정확한 제브라피쉬 모델을 구성하고 이 질병에 대한 약물 스크리닝을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.
시작하려면 마이크로피펫 풀러 시스템을 설정하고 최소 30분 동안 예열하십시오. 유리 모세관을 당기려면 프로그램을 선택하고 r을 설정하십시오.amp 테스트 값을 열로, 50을 당김으로, 속도를 100으로, 시간을 50으로, 압력을 30으로 설정합니다. 그런 다음 모세관이 홈에 있는지 확인합니다.
pull start/stop"을 눌러 프로그램을 실행합니다. 당겨진 모세관을 보존하려면 바늘을 매달아 놓은 틈이 있는 폼에 삽입하십시오. 실험을 위해 원고에 설명된 zSpRY-ABE8e mRNA를 사용하고 양쪽 끝에서 2'O-메틸 포스포로티오에이트로 변형된 sgRNA를 쉽게 편집할 수 있습니다.
gRNA 설계의 경우, zSpRY-ABE8e가 NYN PAM보다 NRN PAM에 대해 더 높은 선호도를 나타내므로 NRN을 PAM 서열로 우선적으로 선택합니다. 타겟 아데닌 뉴클레오티드는 프로토스페이서를 따라 세 번째부터 아홉 번째 뉴클레오티드까지 고활성 편집 창에 들어간다. 주사 전날 밤에 번식 탱크를 설치하십시오.
칸막이를 삽입하고 각 탱크에 암컷 제브라 피쉬 2 마리와 수컷 제브라 피쉬 1 마리를 놓습니다. 각 탱크 위에 뚜껑을 덮습니다. 다음날 아침, RNase가 없는 팁, 튜브 및 장갑을 사용하여 해동된 mRNA와 EEgRNA를 얼음 위에서 각각 마이크로리터당 400 및 200 나노그램의 최종 농도로 혼합합니다.
공압 마이크로 인젝터를 구성하려면 먼저 공기 펌프의 분압 밸브를 닫습니다. 그런 다음 메인 밸브를 열고 가스 실린더의 나사를 풀고 분압 밸브의 압력을 0.2메가파스칼로 조정합니다. 이제 마이크로 인젝터를 켜고 모드를 타이머로 설정합니다.
매개변수 압력 밸브를 제곱인치당 20파운드로 조정하고 타이머 값을 0.040초로 조정합니다. 미세 집게를 사용하여 실체 현미경으로 당겨진 유리 모세관의 바늘을 각도로 부러뜨립니다. 마이크로로더 피펫 팁을 사용하여 mRNA/gRNA 혼합물을 유리 모세관 끝에 추가하고 바늘을 미세 매니퓰레이터에 부착합니다.
마이크로캡을 사용하여 주입당 2나노리터 혼합물을 생성하도록 압력 및 타이머 값을 구성합니다. 10-15 분 동안 물고기를 사육 한 후 여과기에 알을 모으십시오. 실체 현미경으로 세포 단계와 난자의 질을 검사합니다.
편집 효율성을 높이기 위해 주입용 단세포 계란을 선택하십시오. 1.5% 아가로스 주입 플레이트에 난자를 정렬하고 현미경을 사용하여 2나노리터의 RNA 혼합물을 배아 세포에 주입합니다. E3 버퍼가 있는 페트리 접시에 계란을 모아 섭씨 28도에서 배양합니다.
죽은 난자를 제거하고 수정 후 48시간 동안 12시간마다 배양 완충액을 교체합니다. 수정 후 48시간 후, 무작위로 선택된 6개의 주입된 배아로 구성된 3개의 풀을 PCR 튜브에 수집합니다. 무작위로 선택된 6개의 대조군 배아가 수집되면 피펫을 사용하여 잔류 E3 완충액을 흡인합니다.
배아에 40 밀리 몰의 수산화 나트륨 50 마이크로 리터를 첨가하십시오. 튜브를 섭씨 95도의 금속 욕조에 20분 동안 넣은 다음 15초 동안 소용돌이칩니다. pH 8에서 1몰 트리스 염산염 4마이크로리터를 각 튜브에 추가합니다.
튜브를 2000g에서 실온에서 10초 동안 원심분리합니다. 상층액을 새 PCR 튜브로 옮깁니다. PCR 튜브에서 1마이크로리터의 상층액을 제거하고 Sanger 염기서열 분석에 사용합니다.
그런 다음 남은 상청액을 섭씨 20도에서 보관하십시오. Sanger 염기서열 분석 데이터를 분석하려면 먼저 염기서열 분석 파일을 ab1 파일 업로드 상자에 업로드합니다. 20개의 염기쌍 gRNA 염기서열을 5'에서 3' 방향으로 gRNA 염기서열 입력 상자에 입력합니다.
5' 시작 및 3' 끝 상자에 해당 베이스 위치를 입력합니다. 예측 편집"을 클릭하고 시퀀싱 데이터의 품질을 확인하여 기본 편집 효율성을 얻으십시오. 다이아몬드 블랙팬 빈혈 제브라피쉬 모델은 Tsr2의 시작 코돈의 아데닌을 구아닌으로 전환하여 구성되었습니다.
서열 데이터의 EditR 분석은 Tsr2 시작 코돈의 아데닌 염기에서 AG 중첩을 입증했습니다. 생후 2일 된 Tsr2 배아의 표현형은 대조군 배아에 비해 눈이 더 작은 것으로 나타났습니다. 부어오른 심낭도 돌연변이 배아에서 관찰되었습니다.
효율적인 기본 편집을 위해서는 실험의 성공을 위한 전제 조건인 앞서 언급한 지침 설계 원칙을 엄격히 준수하십시오. 정확한 모델은 단일 뉴클레오티드 변이체 관련 질병 연구에 필수적입니다. SprY-ABE8e의 개발은 정확한 모델링을 위한 효과적인 도구를 제공하여 질병 메커니즘 및 치료법 연구를 촉진하는 데 도움이 됩니다.
