Este protocolo permite que os pesquisadores construam um número de modelos de zebrafish previamente indisponíveis de variantes de nucleotídeo único relevantes para a doença. As limitações da PAM são o principal obstáculo para a criação de modelos animais precisos, e o zSpRY-ABE8e permite a conversão eficiente da base de adenina em guanina com baixa intermutação e restrição relaxada da PAN. Esta ferramenta pode ser usada para construir modelos precisos de zebrafish para estudar as características patogênicas dos mecanismos da doença relacionados a fuzileiros navais de nucleotídeo único, bem como a triagem de drogas para esta doença.
Para começar, configure o sistema extrator de micropipetas e pré-aqueça por pelo menos 30 minutos. Para puxar os capilares de vidro, selecione um programa, defina o valor do teste em rampa como calor, 50 como tração, a velocidade em 100, o tempo como 50 e a pressão como 30. Em seguida, instale o tubo capilar garantindo que ele esteja no sulco.
Pressione pull start/stop" para executar o programa. Para preservar os capilares puxados, insira-os em espuma contendo lacunas mantendo a agulha suspensa. Para experimentação, use o mRNA zSpRY-ABE8e descrito no manuscrito e o sgRNA de fácil edição modificado com 2'O-metilfosforotioato em ambas as extremidades.
Para o desenho de gRNA, selecione preferencialmente NRN como a sequência PAM, pois zSpRY-ABE8e mostra uma preferência maior por NRN PAM do que NYN PAM. Digite o nucleotídeo de adenina alvo está na janela de edição altamente ativa do terceiro ao nono nucleotídeo ao longo do protoespaçador. Monte tanques de reprodução na noite anterior à injeção.
Insira uma divisória, colocando duas fêmeas e um macho de peixe-zebra em cada tanque. Coloque uma tampa sobre cada tanque. Na manhã seguinte, usando pontas, tubos e luvas sem RNase, misture o mRNA e o EEgRNA descongelados no gelo até uma concentração final de 400 e 200 nanogramas por microlitro, respectivamente.
Para configurar o microinjetor pneumático, primeiro, feche a válvula de pressão parcial da bomba de ar. Em seguida, abra a válvula principal, desaparafuse o cilindro de gás e ajuste a pressão da válvula de pressão parcial para 0,2 Megapascals. Agora, ligue o microinjetor e defina o modo para temporizador.
Ajuste a válvula de pressão do parâmetro para 20 libras por polegada quadrada e o valor do temporizador para 0,040 segundos. Usando pinças finas, quebre angularmente as agulhas dos capilares de vidro puxados sob um microscópio estéreo. Usando uma ponta de pipeta de microcarregador, adicione a mistura de mRNA/gRNA à ponta de um capilar de vidro e prenda a agulha ao micromanipulador.
Configure o valor da pressão e do temporizador para produzir uma mistura de dois nanolitros por injeção usando uma microtampa. Após a reprodução dos peixes por 10 a 15 minutos, colete os ovos em um coador. Examine o estágio celular e a qualidade do ovo sob o microscópio estéreo.
Selecione ovos unicelulares para injeção para melhorar a eficiência da edição. Forre os ovos em uma placa de injeção de agarose a 1,5% e injete dois nanolitros da mistura de RNA na célula dos embriões usando um microscópio. Recolha os ovos em placas de Petri com E3 Buffer e incube-os a 28 graus Celsius.
Retire os ovos mortos e troque o tampão de cultura a cada 12 horas por 48 horas pós-fertilização. Após 48 horas pós-fecundação, coletar três pools de seis embriões injetados selecionados aleatoriamente em um tubo de PCR. Uma vez que seis embriões controles selecionados aleatoriamente são coletados, use uma pipeta para aspirar o tampão E3 residual.
Adicionar 40 microlitros de hidróxido de sódio 50 milimolares aos embriões. Coloque os tubos em um banho de metal a 95 graus Celsius por 20 minutos e, em seguida, vórtice por 15 segundos. Adicionar quatro microlitros de cloridrato de Tris molar a pH oito em cada tubo.
Centrifugar os tubos a 2000g durante 10 segundos à temperatura ambiente. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de PCR. Remova um microlitro do sobrenadante do tubo de PCR e use-o para o sequenciamento de Sanger.
Em seguida, armazene o sobrenadante restante a 20 graus Celsius. Para analisar os dados de sequenciamento do Sanger, comece carregando o arquivo de sequenciamento na caixa "upload ab1 File". Digite a sequência de 20 pares de bases gRNA na orientação 5'a 3', na caixa de sequência de gRNA".
Insira a posição base correspondente nas caixas 5'start e 3'ends. Obtenha a eficiência de edição de base clicando em edição preditiva e verificando a qualidade dos dados de sequenciamento. Um modelo de peixe-zebra de anemia de diamante blackfan foi construído convertendo a adenina do códon inicial de Tsr2 em guanina.
A análise EditR dos dados de sequência demonstrou uma sobreposição de AG na base de adenina do códon inicial de Tsr2. O fenótipo dos dois embriões Tsr2 de um dia de idade mostrou olhos menores em comparação com os embriões controle. Um pericárdio inchado também foi observado nos embriões mutantes.
A fim de obter uma edição de base eficiente, siga rigorosamente o princípio de design de diretriz mencionado anteriormente, que é um pré-requisito para o sucesso do experimento. Modelos precisos são essenciais para o estudo de doenças relacionadas a variantes de nucleotídeo único. O desenvolvimento do SprY-ABE8e fornece uma ferramenta eficaz para modelagem precisa, que ajuda a promover a pesquisa de mecanismos e tratamentos de doenças.
