Questo protocollo consente ai ricercatori di costruire una serie di modelli di zebrafish precedentemente non disponibili di varianti a singolo nucleotide rilevanti per la malattia. Le limitazioni della PAM sono il principale ostacolo alla creazione di modelli animali accurati e zSpRY-ABE8e consente un'efficiente conversione da adenina a guanina base con bassa intermutazione e restrizione PAN rilassata. Questo strumento può essere utilizzato per costruire modelli accurati di zebrafish per lo studio dei meccanismi patogenetici della malattia correlati ai marini a singolo nucleotide, nonché lo screening farmacologico per questa malattia.
Per iniziare, impostare il sistema di estrazione a micropipette e preriscaldare per almeno 30 minuti. Per tirare i capillari di vetro, selezionare un programma, impostare il valore del test di rampa come calore, 50 come trazione, la velocità a 100, il tempo come 50 e la pressione come 30. Quindi, installare il tubo capillare assicurandosi che sia nella scanalatura.
Premere pull start/stop" per eseguire il programma. Per preservare i capillari tirati, inserirli in schiuma contenente spazi vuoti mantenendo l'ago sospeso. Per la sperimentazione, utilizzare l'mRNA zSpRY-ABE8e descritto nel manoscritto e modificare facilmente l'sgRNA modificato con 2'O-metil fosforotioato ad entrambe le estremità.
Per il disegno del gRNA, selezionare preferenzialmente NRN come sequenza PAM, poiché zSpRY-ABE8e mostra una preferenza maggiore per NRN PAM rispetto a NYN PAM. Inserisci il nucleotide adenina target nella finestra di modifica altamente attiva dal terzo al nono nucleotide lungo il protospaziatore. Allestire vasche di allevamento la notte prima dell'iniezione.
Inserire un divisore, posizionando due femmine e un maschio zebrafish in ogni vasca. Posizionare un coperchio su ciascun serbatoio. La mattina seguente, utilizzando punte, tubi e guanti privi di RNasi, mescolare l'mRNA scongelato e l'EEgRNA sul ghiaccio a una concentrazione finale di 400 e 200 nanogrammi per microlitro, rispettivamente.
Per configurare il microiniettore pneumatico, in primo luogo, chiudere la valvola di pressione parziale della pompa dell'aria. Quindi, aprire la valvola principale, svitare la bombola del gas e regolare la pressione della valvola di pressione parziale a 0,2 Megapascal. Ora, accendere il microiniettore e impostare la modalità su timer.
Regolare la valvola di pressione dei parametri su 20 libbre per pollice quadrato e il valore del timer su 0,040 secondi. Usando una pinza sottile, rompere angolarmente gli aghi dei capillari di vetro tirati sotto un microscopio stereo. Utilizzando la punta di una pipetta microloader, aggiungere la miscela mRNA/gRNA alla punta di un capillare di vetro e collegare l'ago al micromanipolatore.
Configurare il valore della pressione e del timer per produrre due nanolitri di miscela per iniezione utilizzando un microcap. Dopo aver allevato il pesce per 10-15 minuti, raccogliere le uova in un colino. Esaminare lo stadio cellulare e la qualità dell'uovo al microscopio stereo.
Selezionare uova unicellulari per l'iniezione per migliorare l'efficienza di editing. Allineare le uova su una piastra di iniezione di agarosio all'1,5% e iniettare due nanolitri della miscela di RNA nella cellula degli embrioni usando un microscopio. Raccogliere le uova in piastre di Petri con E3 Buffer e incubarle a 28 gradi Celsius.
Rimuovere le uova morte e cambiare il tampone di coltura ogni 12 ore per 48 ore dopo la fecondazione. Dopo 48 ore dalla fecondazione, raccogliere tre pool di sei embrioni iniettati selezionati casualmente in una provetta PCR. Una volta raccolti sei embrioni di controllo selezionati casualmente, utilizzare una pipetta per aspirare il tampone E3 residuo.
Aggiungere 40 microlitri di idrossido di sodio 50 millimolare agli embrioni. Posizionare i tubi in un bagno di metallo a 95 gradi Celsius per 20 minuti, quindi vortice per 15 secondi. Aggiungere quattro microlitri di un molare Tris cloridrato a pH otto in ciascun tubo.
Centrifugare i tubi a 2000g per 10 secondi a temperatura ambiente. Trasferire il surnatante in una nuova provetta per PCR. Rimuovere un microlitro di surnatante dal tubo PCR e utilizzarlo per il sequenziamento Sanger.
Quindi conservare il surnatante rimanente a 20 gradi Celsius. Per analizzare i dati di sequenziamento Sanger, iniziare caricando il file di sequenziamento nella casella carica file ab1. Inserire la sequenza di gRNA di 20 coppie di basi nell'orientamento da 5' a 3' nella casella "sequenza" di invio di gRNA.
Inserite la posizione di base corrispondente nelle caselle 5'start e 3'end. Ottieni l'efficienza di editing di base facendo clic su "editing predittivo" e controllando la qualità dei dati di sequenziamento. Un modello di zebrafish con anemia blackfan di diamante è stato costruito convertendo l'adenina del codone iniziale di Tsr2 in guanina.
L'analisi EditR dei dati di sequenza ha dimostrato una sovrapposizione AG alla base adenina del codone di partenza Tsr2. Il fenotipo dei due embrioni di Tsr2 di un giorno mostrava occhi più piccoli rispetto agli embrioni di controllo. Un pericardio gonfio è stato osservato anche negli embrioni mutanti.
Al fine di ottenere un editing di base efficiente, si prega di seguire rigorosamente il principio di progettazione delle linee guida precedentemente menzionato, che è un prerequisito per il successo dell'esperimento. Modelli accurati sono essenziali per lo studio delle malattie correlate alla variante a singolo nucleotide. Lo sviluppo di SprY-ABE8e fornisce uno strumento efficace per una modellazione accurata, che aiuta a promuovere la ricerca di meccanismi e trattamenti della malattia.
