Ce protocole permet aux chercheurs de construire un certain nombre de modèles de poissons-zèbres auparavant indisponibles de variantes mononucléotidiques pertinentes pour la maladie. Les limitations de PAM sont un obstacle majeur à la création de modèles animaux précis, et zSpRY-ABE8e permet une conversion efficace de l’adénine en base de guanine avec une faible intermutation et une restriction PAN assouplie. Cet outil peut être utilisé pour construire des modèles précis de poisson-zèbre pour étudier les caractéristiques pathogènes des mécanismes pathologiques liés aux marines mononucléotidiques, ainsi que le dépistage de médicaments pour cette maladie.
Pour commencer, installez le système d’extraction de micropipettes et préchauffez pendant au moins 30 minutes. Pour tirer les capillaires en verre, sélectionnez un programme, définissez la valeur de test de rampe sur la chaleur, 50 sur la traction, la vitesse sur 100, le temps sur 50 et la pression sur 30. Ensuite, installez le tube capillaire en vous assurant qu’il est dans la rainure.
Appuyez sur pull start/stop"pour exécuter le programme. Pour préserver les capillaires tirés, insérez-les dans de la mousse contenant des trous maintenant l’aiguille suspendue. Pour l’expérimentation, utilisez l’ARNm zSpRY-ABE8e décrit dans le manuscrit, et modifiez facilement l’ARNg modifié avec du phosphorothioate de 2'O-méthyle aux deux extrémités.
Pour la conception de l’ARNg, sélectionnez de préférence NRN comme séquence PAM, car zSpRY-ABE8e montre une préférence plus élevée pour NRN PAM que NYN PAM. Entrez le nucléotide adénine cible est dans la fenêtre d’édition hautement active du troisième au neuvième nucléotide le long du protospacer. Installez des bassins d’élevage la veille de l’injection.
Insérez un séparateur en plaçant deux poissons-zèbres femelles et un poisson zèbre mâle dans chaque réservoir. Placez un couvercle sur chaque réservoir. Le lendemain matin, à l’aide d’embouts, de tubes et de gants sans RNase, mélangez l’ARNm décongelé et l’EEgRNA sur de la glace à une concentration finale de 400 et 200 nanogrammes par microlitre, respectivement.
Pour configurer le microinjecteur pneumatique, fermez d’abord la soupape de pression partielle de la pompe à air. Ensuite, ouvrez la vanne principale, dévissez la bouteille de gaz et ajustez la pression de la soupape de pression partielle à 0,2 mégapascal. Maintenant, allumez le micro-injecteur et réglez le mode sur minuterie.
Ajustez le paramètre soupape de pression à 20 livres par pouce carré et la valeur de la minuterie à 0,040 seconde. À l’aide de pinces fines, casser angulairement les aiguilles des capillaires en verre tiré sous un stéréomicroscope. À l’aide d’une pointe de pipette de microchargeur, ajoutez le mélange ARNm/ARNg à l’extrémité d’un capillaire en verre et fixez l’aiguille au micromanipulateur.
Configurez la pression et la valeur de la minuterie pour produire un mélange de deux nanolitres par injection à l’aide d’un microcapuchon. Après avoir élevé le poisson pendant 10 à 15 minutes, ramassez les œufs dans une passoire. Examinez le stade cellulaire et la qualité des œufs au stéréomicroscope.
Sélectionnez des œufs unicellulaires à injecter pour améliorer l’efficacité de l’édition. Alignez les œufs sur une plaque d’injection d’agarose à 1,5% et injectez deux nanolitres du mélange d’ARN dans la cellule des embryons à l’aide d’un microscope. Collectez les œufs dans des boîtes de Petri avec E3 Buffer et incuberez-les à 28 degrés Celsius.
Retirez les œufs morts et changez le tampon de culture toutes les 12 heures pendant 48 heures après la fécondation. Après 48 heures après la fécondation, prélever trois groupes de six embryons injectés sélectionnés au hasard dans un tube de PCR. Une fois que six embryons témoins sélectionnés au hasard sont recueillis, utilisez une pipette pour aspirer le tampon E3 résiduel.
Ajouter 40 microlitres d’hydroxyde de sodium 50 millimolaires aux embryons. Placez les tubes dans un bain métallique à 95 degrés Celsius pendant 20 minutes, puis vortex pendant 15 secondes. Ajouter quatre microlitres d’une molaire de chlorhydrate de Tris à pH huit dans chaque tube.
Centrifuger les tubes à 2000g pendant 10 secondes à température ambiante. Transférer le surnageant dans un nouveau tube PCR. Retirez un microlitre du surnageant du tube PCR et utilisez-le pour le séquençage de Sanger.
Conservez ensuite le surnageant restant à 20 degrés Celsius. Pour analyser les données de séquençage de Sanger, commencez par télécharger le fichier de séquençage dans la boîte de téléchargement du fichier ab1. Entrez la séquence d’ARNg de 20 paires de bases dans l’orientation 5' à 3' dans la case de séquence d’entrée"ARNg ».
Entrez la position de base correspondante dans les cases 5'start et 3'ends. Obtenez l’efficacité d’édition de base en cliquant sur l’édition prédictive et en vérifiant la qualité des données de séquençage. Un modèle de poisson zèbre anémique noire en diamant a été construit en convertissant l’adénine du codon de départ de Tsr2 en guanine.
L’analyse EditR des données de séquence a démontré un chevauchement AG à la base adénine du codon de départ Tsr2. Le phénotype des embryons Tsr2 âgés de deux jours présentait des yeux plus petits que les embryons témoins. Un péricarde gonflé a également été observé dans les embryons mutants.
Afin d’obtenir une édition de base efficace, veuillez suivre strictement le principe de conception des lignes directrices mentionné précédemment, qui est une condition préalable au succès de l’expérience. Des modèles précis sont essentiels pour l’étude des maladies liées à des variantes mononucléotidiques. Le développement du SprY-ABE8e fournit un outil efficace pour une modélisation précise, ce qui contribue à promouvoir la recherche sur les mécanismes et les traitements des maladies.
