Dieses Protokoll ermöglicht es den Forschern, eine Reihe von bisher nicht verfügbaren Zebrafischmodellen von krankheitsrelevanten Einzelnukleotidvarianten zu erstellen. PAM-Einschränkungen sind ein großes Hindernis für die Erstellung genauer Tiermodelle, und zSpRY-ABE8e ermöglicht eine effiziente Umwandlung von Adenin in Guanin-Basen mit geringer Intermutation und entspannter PAN-Restriktion. Dieses Werkzeug kann verwendet werden, um genaue Zebrafischmodelle zu konstruieren, um die pathogenen Eigenschaften von Krankheitsmechanismen im Zusammenhang mit Einzelnukleotidmarinen zu untersuchen und Medikamente auf diese Krankheit zu untersuchen.
Richten Sie zunächst das Mikropipettenziehsystem ein und heizen Sie es mindestens 30 Minuten lang vor. Um die Glaskapillaren zu ziehen, wählen Sie ein Programm aus, stellen Sie den Rampentestwert als Wärme, 50 als Zug, die Geschwindigkeit als 100, die Zeit als 50 und den Druck als 30 ein. Installieren Sie als Nächstes das Kapillarrohr und stellen Sie sicher, dass es sich in der Nut befindet.
Drücken Sie Pull Start/Stop", um das Programm auszuführen. Um die gezogenen Kapillaren zu schonen, führen Sie sie in Schaumstoff ein, der Lücken enthält, so dass die Nadel in der Schwebe bleibt. Verwenden Sie für Experimente die im Manuskript beschriebene zSpRY-ABE8e-mRNA und editieren Sie sgRNA, die an beiden Enden mit 2'O-Methylphosphorothioat modifiziert wurde.
Für das gRNA-Design ist bevorzugt NRN als PAM-Sequenz zu wählen, da zSpRY-ABE8e eine höhere Präferenz für NRN-PAM als NYN-PAM zeigt. Geben Sie das Ziel-Adenin-Nukleotid in das hochaktive Editierfenster vom dritten bis zum neunten Nukleotid entlang des Protospacers ein. Stellen Sie in der Nacht vor der Injektion Aufzuchtbecken.
Setzen Sie eine Trennwand ein und legen Sie zwei weibliche und einen männlichen Zebrafisch in jedes Becken. Legen Sie einen Deckel über jeden Tank. Am nächsten Morgen mischen Sie die aufgetaute mRNA und EEgRNA auf Eis mit RNase-freien Spitzen, Röhrchen und Handschuhen auf eine Endkonzentration von 400 bzw. 200 Nanogramm pro Mikroliter.
Um den pneumatischen Mikroinjektor zu konfigurieren, schließen Sie zunächst das Partialdruckventil der Luftpumpe. Öffnen Sie dann das Hauptventil, schrauben Sie die Gasflasche ab und stellen Sie den Druck des Partialdruckventils auf 0,2 Megapascal ein. Schalten Sie nun den Mikroinjektor ein und stellen Sie den Modus auf Timer.
Stellen Sie den Parameter Druckventil auf 20 Pfund pro Quadratzoll und den Timer-Wert auf 0,040 Sekunden ein. Brechen Sie mit einer feinen Pinzette die Nadeln der gezogenen Glaskapillaren unter einem Stereomikroskop schräg auf. Geben Sie das mRNA/gRNA-Gemisch mit einer Microloader-Pipettenspitze in die Spitze einer Glaskapillare und befestigen Sie die Nadel am Mikromanipulator.
Konfigurieren Sie den Druck- und Timer-Wert so, dass mit einer Mikrokappe ein Zwei-Nanoliter-Gemisch pro Injektion erzeugt wird. Nachdem Sie den Fisch 10 bis 15 Minuten lang gezüchtet haben, sammeln Sie die Eier in einem Sieb. Untersuchen Sie das Zellstadium und die Eiqualität unter dem Stereomikroskop.
Wählen Sie einzellige Eizellen für die Injektion aus, um die Bearbeitungseffizienz zu verbessern. Legen Sie die Eizellen auf eine 1,5%ige Agarose-Injektionsplatte und injizieren Sie zwei Nanoliter der RNA-Mischung mit einem Mikroskop in die Zelle der Embryonen. Sammeln Sie die Eier in Petrischalen mit E3-Puffer und bebrüten Sie sie bei 28 Grad Celsius.
Entfernen Sie die toten Eizellen und wechseln Sie den Kulturpuffer 48 Stunden nach der Befruchtung alle 12 Stunden. Nach 48 Stunden nach der Befruchtung werden drei Pools mit sechs zufällig ausgewählten injizierten Embryonen in ein PCR-Röhrchen gesammelt. Sobald sechs zufällig ausgewählte Kontrollembryonen entnommen wurden, verwenden Sie eine Pipette, um den verbleibenden E3-Puffer abzusaugen.
Fügen Sie den Embryonen 40 Mikroliter 50 millimolare Natriumhydroxid hinzu. Legen Sie die Röhrchen für 20 Minuten in ein Metallbad bei 95 Grad Celsius und wirbeln Sie sie dann 15 Sekunden lang. Geben Sie vier Mikroliter eines molaren Trishydrochlorids bei einem pH-Wert von acht in jedes Röhrchen.
Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 2000 g für 10 Sekunden bei Raumtemperatur. Übertragen Sie den Überstand in ein neues PCR-Röhrchen. Entfernen Sie einen Mikroliter des Überstands aus dem PCR-Röhrchen und verwenden Sie ihn für die Sanger-Sequenzierung.
Den restlichen Überstand dann bei 20 Grad Celsius lagern. Um die Sanger-Sequenzierungsdaten zu analysieren, laden Sie zunächst die Sequenzierungsdatei in das Feld "ab1-Datei hochladen" hoch. Geben Sie die gRNA-Sequenz mit 20 Basenpaaren in der Orientierung von 5's bis 3' in das Feld "gRNA"-Sequenz eingeben ein.
Geben Sie die entsprechende Basisposition in die Felder 5'start und 3'ends ein. Erzielen Sie die Effizienz der Basisbearbeitung, indem Sie auf "Predictive Editing" klicken und die Qualität der Sequenzierungsdaten überprüfen. Ein Diamond-Blackfan-Anämie-Zebrafischmodell wurde konstruiert, indem das Adenin des Startcodons von Tsr2 in Guanin umgewandelt wurde.
Die EditR-Analyse der Sequenzdaten zeigte eine AG-Überlappung an der Adeninbase des Tsr2-Startcodons. Der Phänotyp der beiden einen Tag alten Tsr2-Embryonen zeigte im Vergleich zu den Kontrollembryonen kleinere Augen. Auch bei den mutierten Embryonen wurde ein geschwollener Perikard beobachtet.
Um eine effiziente Basenbearbeitung zu erreichen, halten Sie sich bitte strikt an das zuvor erwähnte Guideline-Design-Prinzip, das Voraussetzung für den Erfolg des Experiments ist. Genaue Modelle sind für die Untersuchung von Krankheiten, die mit Einzelnukleotidvarianten in Verbindung stehen, unerlässlich. Die Entwicklung des SprY-ABE8e bietet ein effektives Werkzeug für eine genaue Modellierung, das dazu beiträgt, die Erforschung von Krankheitsmechanismen und -behandlungen zu fördern.
