Этот протокол позволяет исследователям построить ряд ранее недоступных моделей рыбок данио-рерио однонуклеотидных вариантов, связанных с заболеванием. Ограничения PAM являются основным препятствием для создания точных моделей на животных, и zSpRY-ABE8e обеспечивает эффективное преобразование аденина в гуаниновое основание с низкой интермутацией и ослабленным ограничением PAN. Этот инструмент может быть использован для построения точных моделей рыбок данио-рерио для изучения патогенных характеристик механизмов заболевания, связанных с однонуклеотидными морскими пехотинцами, а также для скрининга лекарств от этого заболевания.
Для начала настройте систему съемников микропипеток и разогрейте не менее 30 минут. Чтобы вытянуть стеклянные капилляры, выберите программу, установите значение импульсного теста как тепло, 50 как тягу, скорость 100, время как 50 и давление как 30. Затем установите капиллярную трубку, убедившись, что она находится в канавке.
Нажмите «Потяните старт/стоп», чтобы запустить программу. Чтобы сохранить вытянутые капилляры, вставьте их в пену, содержащую зазоры, удерживающие иглу в подвешенном состоянии. Для экспериментов используйте мРНК zSpRY-ABE8e, описанную в рукописи, и легко редактируйте sgRNA, модифицированную 2'O-метилфосфоротиоатом на обоих концах.
Для дизайна гРНК предпочтительно выберите NRN в качестве последовательности PAM, поскольку zSpRY-ABE8e демонстрирует более высокое предпочтение NRN PAM, чем NYN PAM. Введите целевой адениновый нуклеотид в высокоактивное окно редактирования от третьего до девятого нуклеотида вдоль протоспейсера. Установите резервуары для разведения в ночь перед инъекцией.
Вставьте разделитель, поместив в каждый аквариум по две самки и одного самца данио. Накройте каждый резервуар крышкой. На следующее утро, используя наконечники, пробирки и перчатки без РНКазы, смешайте размороженную мРНК и EEgRNA на льду до конечной концентрации 400 и 200 нанограммов на микролитр соответственно.
Чтобы настроить пневматический микроинжектор, сначала закройте клапан парциального давления воздушного насоса. Затем откройте главный клапан, открутите газовый баллон и отрегулируйте давление клапана парциального давления до 0.2 мегапаскалей. Теперь включаем микроинжектор и устанавливаем режим на таймер.
Отрегулируйте параметр нагнетательного клапана на 20 фунтов на квадратный дюйм и значение таймера на 0.040 секунды. С помощью тонких щипцов угловато разбивают иглы вытянутых стеклянных капилляров под стереомикроскопом. Используя наконечник пипетки микрозагрузчика, добавьте смесь мРНК/гРНК к кончику стеклянного капилляра и присоедините иглу к микроманипулятору.
Настройте давление и значение таймера для получения смеси в два нанолитра за инъекцию с использованием микроколпачка. После разведения рыбы в течение 10 – 15 минут соберите икру в ситечко. Исследуйте стадию клетки и качество яйцеклетки под стереомикроскопом.
Выберите одноклеточные яйцеклетки для инъекций, чтобы повысить эффективность редактирования. Выстройте яйцеклетки на 1,5%-ной пластине для инъекций агарозы и введите два нанолитра смеси РНК в клетку эмбрионов с помощью микроскопа. Соберите яйца в чашках Петри с буфером E3 и инкубируйте их при температуре 28 градусов Цельсия.
Удалите мертвые яйца и меняйте культуральный буфер каждые 12 часов в течение 48 часов после оплодотворения. Через 48 часов после оплодотворения соберите три пула из шести случайно выбранных эмбрионов в ПЦР-пробирку. После того, как шесть случайно выбранных контрольных эмбрионов собраны, используйте пипетку для аспирации остаточного буфера E3.
Добавьте 40 микролитров 50 миллимолярного гидроксида натрия к эмбрионам. Поместите трубки в металлическую ванну при температуре 95 градусов Цельсия на 20 минут, а затем встряхните в течение 15 секунд. Добавьте четыре микролитра одного молярного гидрохлорида триса при рН восемь в каждую пробирку.
Центрифугируйте пробирки при 2000 г в течение 10 секунд при комнатной температуре. Перенесите надосадочную жидкость в новую ПЦР-пробирку. Извлеките один микролитр надосадочной жидкости из ПЦР-пробирки и используйте его для секвенирования по Сэнгеру.
Затем храните оставшуюся надосадочную жидкость при температуре 20 градусов Цельсия. Чтобы проанализировать данные секвенирования Сэнгера, начните с загрузки файла виртуализации в поле «Загрузить файл ab1». Введите последовательность гРНК из 20 пар оснований в ориентации от 5 до 3 футов в поле последовательности ввода гРНК.
Введите соответствующее базовое положение в поля 5'start и 3'ends. Получите эффективность базового редактирования, нажав на предиктивное редактирование» и проверив качество данных секвенирования. Была построена модель анемии данио-рерио алмаза путем преобразования аденина стартового кодона Tsr2 в гуанин.
Анализ данных последовательности EditR показал перекрытие AG в адениновом основании стартового кодона Tsr2. Фенотип двух суточных эмбрионов Tsr2 показал меньшие глаза по сравнению с контрольными эмбрионами. Опухший перикард также наблюдался у мутантных эмбрионов.
Чтобы добиться эффективного редактирования базы, пожалуйста, строго следуйте ранее упомянутому принципу проектирования руководящих принципов, что является предпосылкой для успеха эксперимента. Точные модели необходимы для изучения заболеваний, связанных с однонуклеотидным вариантом. Разработка SprY-ABE8e обеспечивает эффективный инструмент для точного моделирования, который помогает продвигать исследования механизмов заболевания и методов лечения.
