Bu protokol, araştırmacıların hastalıkla ilgili tek nükleotid varyantlarının daha önce kullanılamayan bir dizi zebra balığı modelini oluşturmalarını sağlar. PAM sınırlamaları, doğru hayvan modelleri oluşturmanın önündeki en büyük engeldir ve zSpRY-ABE8e, düşük intermutasyon ve rahat PAN kısıtlaması ile verimli adenin-guanin baz dönüşümü sağlar. Bu araç, tek nükleotid denizcilerle ilgili patojenik özellikleri hastalık mekanizmalarını incelemek için doğru zebra balığı modelleri oluşturmak ve bu hastalık için ilaç taraması yapmak için kullanılabilir.
Başlamak için, mikropipet çektirme sistemini kurun ve en az 30 dakika önceden ısıtın. Cam kılcal damarları çekmek için bir program seçin, rampa test değerini ısı, 50 çekme, hızı 100, zaman 50 ve basınç 30 olarak ayarlayın. Ardından, kılcal boruyu olukta olduğundan emin olacak şekilde takın.
Programı çalıştırmak için pull start/stop "düğmesine basın. Çekilen kılcal damarları korumak için, iğneyi asılı tutan boşluklar içeren köpük içine yerleştirin. Deney için, makalede açıklanan zSpRY-ABE8e mRNA'yı kullanın ve her iki ucunda 2'O-metil fosforothioat ile modifiye edilmiş kolay düzenleme sgRNA'sı kullanın.
gRNA tasarımı için, tercihen PAM dizisi olarak NRN'yi seçin, çünkü zSpRY-ABE8e, NRN PAM için NYN PAM'dan daha yüksek bir tercih gösterir. Hedef adenin nükleotidi, protospacer boyunca üçüncüden dokuzuncu nükleotite kadar oldukça aktif düzenleme penceresindedir. Enjeksiyondan önceki gece üreme tankları kurun.
Her tanka iki dişi ve bir erkek zebra balığı yerleştirerek bir bölücü yerleştirin. Her tankın üzerine bir kapak yerleştirin. Ertesi sabah, RNaz içermeyen uçlar, tüpler ve eldivenler kullanarak, çözülmüş mRNA ve EEgRNA'yı buz üzerinde sırasıyla mikrolitre başına 400 ve 200 nanogramlık nihai bir konsantrasyona karıştırın.
Pnömatik mikroenjektörünü yapılandırmak için, önce hava pompasının kısmi basınç valfini kapatın. Ardından, ana valfi açın, gaz tüpünü sökün ve kısmi basınç valfinin basıncını 0,2 Megapaskal'a ayarlayın. Şimdi, mikro enjektörü açın ve modu zamanlayıcı olarak ayarlayın.
Parametre basınç valfini inç kare başına 20 pound'a ve zamanlayıcı değerini 0.040 saniyeye ayarlayın. İnce forseps kullanarak, çekilen cam kılcal damarların iğnelerini stereo mikroskop altında açısal olarak kırın. Bir mikroyükleyici pipet ucu kullanarak, mRNA/gRNA karışımını bir cam kılcal damarın ucuna ekleyin ve iğneyi mikromanipülatöre takın.
Bir mikrokapak kullanarak enjeksiyon başına iki nanolitre karışımı üretmek için basınç ve zamanlayıcı değerini yapılandırın. Balıkları 10 ila 15 dakika yetiştirdikten sonra, yumurtaları bir süzgeçte toplayın. Stereo mikroskop altında hücre evresini ve yumurta kalitesini inceleyin.
Düzenleme verimliliğini artırmak için enjeksiyon için tek hücreli yumurtaları seçin. Yumurtaları% 1.5'lik bir agaroz enjeksiyon plakasına hizalayın ve bir mikroskop kullanarak embriyoların hücresine iki nanolitre RNA karışımı enjekte edin. Yumurtaları E3 Tamponlu Petri kaplarında toplayın ve 28 santigrat derecede inkübe edin.
Ölü yumurtaları çıkarın ve döllenme sonrası 48 saat boyunca her 12 saatte bir kültür tamponunu değiştirin. Döllenmeden 48 saat sonra, rastgele seçilmiş altı enjekte edilmiş embriyodan oluşan üç havuzu bir PCR tüpüne toplayın. Rastgele seçilmiş altı kontrol embriyosu toplandıktan sonra, kalan E3 Arabelleğini aspire etmek için bir pipet kullanın.
Embriyolara 40 mikrolitre 50 milimolar sodyum hidroksit ekleyin. Tüpleri 20 dakika boyunca 95 santigrat derecede metal bir banyoya yerleştirin ve ardından 15 saniye boyunca girdap yapın. Her tüpe pH sekizde dört mikrolitre bir molar Tris hidroklorür ekleyin.
Tüpleri oda sıcaklığında 10 saniye boyunca 2000g'de santrifüj edin. Süpernatantı yeni bir PCR tüpüne aktarın. Süpernatantın bir mikrolitresini PCR tüpünden çıkarın ve Sanger dizilimi için kullanın.
Daha sonra kalan süpernatantı 20 santigrat derecede saklayın. Sanger sıralama verilerini analiz etmek için, sıralama dosyasını ab1 Dosyasını Yükle" kutusuna yükleyerek başlayın. 20 baz çifti gRNA dizisini 5'ila 3'oryantasyonda gRNA gir" dizisi kutusuna girin.
İlgili taban konumunu 5'start ve 3'end kutularına girin. Tahmine dayalı düzenleme"ye tıklayarak ve sıralama verilerinin kalitesini kontrol ederek temel düzenleme verimliliğini elde edin. Tsr2'nin başlangıç kodonunun adeninini guanin'e dönüştürerek elmas blackfan anemi zebra balığı modeli inşa edildi.
Dizi verilerinin EditR analizi, Tsr2 başlangıç kodonunun adenin tabanında bir AG çakışması olduğunu gösterdi. İki günlük Tsr2 embriyolarının fenotipi, kontrol embriyolarına kıyasla daha küçük gözler gösterdi. Mutant embriyolarda şişmiş bir perikard da gözlendi.
Verimli temel düzenleme elde etmek için, lütfen deneyin başarısı için bir ön koşul olan daha önce belirtilen kılavuz tasarım ilkesine kesinlikle uyun. Tek nükleotid varyantı ile ilişkili hastalıkların incelenmesi için doğru modeller gereklidir. SprY-ABE8e'nin geliştirilmesi, hastalık mekanizmalarının ve tedavilerinin araştırılmasını teşvik etmeye yardımcı olan doğru modelleme için etkili bir araç sağlar.
