Este protocolo permite a los investigadores construir una serie de modelos de pez cebra previamente no disponibles de variantes de un solo nucleótido relevantes para la enfermedad. Las limitaciones de PAM son un obstáculo importante para crear modelos animales precisos, y zSpRY-ABE8e permite una conversión eficiente de adenina a base de guanina con baja intermutación y restricción de PAN relajada. Esta herramienta se puede utilizar para construir modelos precisos de pez cebra para estudiar las características patogénicas de los mecanismos de la enfermedad relacionados con los marinos de un solo nucleótido, así como la detección de fármacos para esta enfermedad.
Para empezar, configure el sistema extractor de micropipetas y precaliente durante al menos 30 minutos. Para tirar de los capilares de vidrio, seleccione un programa, establezca el valor de la prueba de rampa como calor, 50 como tracción, la velocidad en 100, el tiempo como 50 y la presión en 30. A continuación, instale el tubo capilar asegurándose de que esté en la ranura.
Presione pull start/stop" para ejecutar el programa. Para preservar los capilares extraídos, insértelos en espuma que contenga espacios que mantengan la aguja suspendida. Para la experimentación, use el ARNm zSpRY-ABE8e descrito en el manuscrito, y edite fácilmente el ARNg modificado con fosforotioato de 2'O-metilo en ambos extremos.
Para el diseño de ARNg, seleccione preferentemente NRN como la secuencia PAM, ya que zSpRY-ABE8e muestra una mayor preferencia por NRN PAM que NYN PAM. Ingrese el nucleótido de adenina objetivo en la ventana de edición altamente activa del tercer al noveno nucleótido a lo largo del protoespaciador. Instale tanques de cría la noche antes de la inyección.
Inserte un divisor, colocando dos peces cebra hembra y uno macho en cada tanque. Coloque una tapa sobre cada tanque. A la mañana siguiente, usando puntas, tubos y guantes libres de RNasa, mezcle el ARNm descongelado y el ARNeg en hielo hasta una concentración final de 400 y 200 nanogramos por microlitro, respectivamente.
Para configurar el microinyector neumático, primero, cierre la válvula de presión parcial de la bomba de aire. Luego, abra la válvula principal, desenrosque el cilindro de gas y ajuste la presión de la válvula de presión parcial a 0.2 Megapascales. Ahora, encienda el microinyector y configure el modo en temporizador.
Ajuste la válvula de presión del parámetro a 20 libras por pulgada cuadrada y el valor del temporizador a 0.040 segundos. Usando pinzas finas, rompa angularmente las agujas de los capilares de vidrio tirado bajo un microscopio estéreo. Con la punta de una pipeta del microcargador, añada la mezcla de ARNm/ARNg a la punta de un capilar de vidrio y conecte la aguja al micromanipulador.
Configure el valor de presión y temporizador para producir dos nanolitros de mezcla por inyección utilizando una microcápsula. Después de criar los peces durante 10 a 15 minutos, recoja los huevos en un colador. Examine la etapa celular y la calidad del huevo bajo el microscopio estéreo.
Seleccione huevos unicelulares para inyección para mejorar la eficiencia de edición. Alinee los huevos en una placa de inyección de agarosa al 1,5% e inyecte dos nanolitros de la mezcla de ARN en la célula de los embriones con un microscopio. Recoja los huevos en placas de Petri con E3 Buffer e incubarlos a 28 grados centígrados.
Retire los huevos muertos y cambie el tampón de cultivo cada 12 horas durante 48 horas después de la fertilización. Después de 48 horas después de la fertilización, recolecte tres grupos de seis embriones inyectados seleccionados al azar en un tubo de PCR. Una vez que se hayan recolectado seis embriones de control seleccionados al azar, use una pipeta para aspirar el tampón E3 residual.
Agregue 40 microlitros de hidróxido de sodio milimolar a los embriones. Coloque los tubos en un baño de metal a 95 grados centígrados durante 20 minutos, y luego vórtice durante 15 segundos. Agregue cuatro microlitros de un clorhidrato de Tris molar a pH ocho en cada tubo.
Centrifugar los tubos a 2000g durante 10 segundos a temperatura ambiente. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de PCR. Retire un microlitro del sobrenadante del tubo de PCR y utilícelo para la secuenciación de Sanger.
Luego guarde el sobrenadante restante a 20 grados centígrados. Para analizar los datos de secuenciación de Sanger, comience cargando el archivo de secuenciación en el cuadro upload ab1 File". Introduzca la secuencia de ARNg de 20 pares de bases en la orientación de 5' a 3' en el cuadro de secuencia de introducción de ARNg.
Introduzca la posición base correspondiente en los cuadros 5'start y 3'ends. Obtenga la eficiencia de edición base haciendo clic en edición predictiva" y verificando la calidad de los datos de secuenciación. Se construyó un modelo de pez cebra con anemia de diamante blackfan convirtiendo la adenina del codón de inicio de Tsr2 en guanina.
El análisis EditR de los datos de secuencia demostró una superposición de AG en la base de adenina del codón de inicio Tsr2. El fenotipo de los embriones Tsr2 de dos días de edad mostró ojos más pequeños en comparación con los embriones de control. También se observó un pericardio hinchado en los embriones mutantes.
Para lograr una edición de base eficiente, siga estrictamente el principio de diseño de directrices mencionado anteriormente, que es un requisito previo para el éxito del experimento. Los modelos precisos son esenciales para el estudio de enfermedades relacionadas con variantes de un solo nucleótido. El desarrollo del SprY-ABE8e proporciona una herramienta eficaz para el modelado preciso, que ayuda a promover la investigación de los mecanismos y tratamientos de la enfermedad.
