크기, 모양, 및 결합 된 이다의 네트워크의 방향 분석

요약

여기 astrocytic 네트워크의 조직 평가 프로토콜 선물이. 설명된 방법 셀 수, 크기, 지역, 및 핵 내의 위치 등이 네트워크의 기술적인 조치를 제공 하는 바이어스를 최소화 합니다. 이방성 vectorial 분석 평가 이다.

초록

그것은 이다 네트워크 수준에서 뿐만 아니라 시 냅 스 및 단일 세포 수준에서 뿐만 아니라 신경 기능 조절 점점 더 분명 되었다. 이다는 강력 하 게 서로 연결 간격 접속 점을 통해 이며 커플링이이 접합을 통해 역동적이 고 높은 규제. 새로운 개념은 astrocytic 함수는 전문화 하 고 그들은 연결 하는 신경 회로의 기능에 맞게. 따라서, 더 나은 그들의 통신을 제어 하 고 커플링 규칙을 설명 하 고 그들의 기능을 더욱 이해 하 astrocytic 네트워크의 다양 한 매개 변수를 측정 하는 방법이 필요 합니다.

여기, 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 (예., ImageJFIJI), 염료 커플링 공개 astrocytic 네트워크의 공초점 이미지를 분석 하는 방법을 설명. 이러한 방법은 허용 1)는 자동화 되 고 편견 검색 레이블이 지정 된 셀의 2) 3) 염료는 네트워크 내에서 확산과 4) 관심의 영역 내에서 네트워크의 위치에의 우선 방향 계산 네트워크의 크기의 계산 .

이 분석은 특정 영역의 astrocytic 네트워크 특성, 비교 다른 기능에 관련 된 다른 분야의 네트워크 또는 네트워크 연결에 서로 다른 영향을 서로 다른 조건 하에서 얻은 비교를 사용할 수 있습니다. 이러한 관측 기능 중요 한 고려 사항이 될 수 있습니다. 예를 들어, 우리가 어디 우리가 이전 나타났습니다 astrocytic 커플링 리듬 붕괴¹토 닉에서 그들의 발사 패턴을 전환 하는 뉴런의 기능을 위해 필수적 이다 trigeminal 핵의 astrocytic 네트워크 분석. 크기, 감 금, 그리고이 핵에서 astrocytic 네트워크의 우선 방향을 측정, 우리 그들은 등 기능 도메인에 대 한 가설을 구축할 수 있습니다. 여러 연구 결과 시상 및 몇 가지 이름으로, 시각 피 질에 신 피 질, 측면 우수한 올리브, 후 각 glomeruli, 및 감각 핵을 포함 하 여 다른 몇몇 두뇌 지역 유사한 분석 으로부터 혜택을 받을 수는 것이 좋습니다.

서문

많은 연구는 어떻게 하위 셀룰러 또는 시 냅 스 수준에서 신경-사이토 대화 신경 기능 및 시 냅 스 전송에 영향을 가질 수 있습니다 설명 했습니다. 그것은 잘 이다 주변 신경 활동에 민감합니다 설립 사실, 그들은 많은 신경 전달 물질 등 조미료, GABA, 아 세 틸 콜린, ATP (이전에 게시 리뷰^2,,34참조)에 대 한 수용 체가 있다. 반환에서는, astrocytic 처리 ensheath 시 냅 스 요소와 영향 신경 활동 거기와 extrasynaptic 사이트에 extracellular 이온 항상성 조절 하 고 여러 요인 또는 송신기 조미료, D-떠들고, ATP 등을 발표 하 여 ^{5 , 6 , 7}.

Astrocytic 커플링은 공간적으로 통제 되 고 취소 해 부 특징 영역에서 신경 세그먼트에 해당 하는 증거 이다 네트워크 수준에서 신경 기능 조절 또한 수 아이디어가 나왔다 (같은 감각 표현 영역), 구획 이다 보다는 그냥 그 근처는 같은 기능을 제공 하는 다른 이다에 커플 것입니다 나타냅니다. 측면 우수한 올리브에서 예를 들어, 가장 astrocytic 네트워크는⁸tonotopic 축 직교 방향 신 피 질 또는 olfactoty glomeruli 이다 간의 통신 배럴 또는 glomeruli 훨씬 더 강한 반면 그리고 인접 한 것 들^9,10사이 약한. 두 경우 모두, astrocytic 네트워크는 glomerule 또는 배럴^9,10의 중심을 향해 지향.

우리는 최근 astrocytic 활동의 extracellular 캘리포니아^{2 +} 농도 감소 시켜 신경 발포 변조 보였다 ([캘리포니아^{2 +}]_e), S100β, 캘리포니아^{2 +}의 출시를 통해 아마도-바인딩 단백질¹¹. 감각 trigeminal 메인의 등 쪽 부분에 trigeminal rhythmogenic 뉴런의 인구에서 시연 되었다는 사실에서 유래한 다 핵 (NVsnpr, masticatory의 생성에 중요 한 역할을 생각),이 효과 이러한 뉴런에 리듬 발사는 영구 나⁺ 현재 [캘리포니아^{2 +}]_e^11,12의 감소에 의해 추진에 따라 달라 집니다. 이러한 뉴런에 리듬 발사 그들의 입력의 자극 또는 인공 감소 [캘리포니아^{2 +}]_e의 "순수" elicited 수 있습니다. 우리는 더 astrocytic 커플링 신경 리듬 발사¹필요 이었다는 것을 보여주었다. 이 astrocytic 네트워크 신경 활동을 동기화 할 수 및 조정 circumscribed 기능 도메인을 형성 수 있습니다 가능성 제기. 이 가설을 평가 하기 위해 우리가 먼저를 엄격 하 게 NVsnpr 내에서 이러한 네트워크의 조직 방법을 개발 필요 합니다.

Astrocytic 네트워크에 대 한 이전 연구 대부분 휴대폰 번호와 밀도 및 영역 결합의 정도 설명 했습니다. Astrocytic 네트워크의 형태와 염료-커플링의 방향 평가 하려고 했다 주로 배럴 피⁹, 마^13,14, 두 개의 축 (x와 y)에 따라 네트워크의 크기를 비교 하 여 수행 ¹⁵, barreloid 분야 시상¹⁶, 측면 우수한 올리브⁸, 후 각 glomeruli¹⁰, 피 질¹⁴의. 여기에 설명 된 메서드는 네트워크에 있는 레이블된 셀의 편견된 수와 그들이 커버 영역의 추정 가능 우리는 또한 네트워크 내에서 연결의 기본 설정된 방향을 정의 하 고 핵의 또는 다른 방향에서 중심으로 원하는 방향 인지 평가 도구를 개발 했다. 이전에 사용한 방법에 비해이 프로토콜 조직 및 알려진 취소 해 부가 없는 지 trigeminal 주 감각 핵 같은 구조에 astrocytic 네트워크의 방향을 설명 하는 수단 제공 서입니다. 위의 연구에서 네트워크 방향으로 이미 문서화 구조 자체의 모양에 관계 설명 (예., 시상, 피 질, 배럴에에서 barreloid 해 마와 피 질,에서 glomeruli 레이어 후 각 전구, 등입니다.)입니다. 또한, vectorial 분석 방향 밝혀 다른 조건 하에서 커플링의 비교에 대 한 수 있습니다. 이러한 매개 변수는 핵 내에서 네트워크의 위치에 따라 변경 여부 분석, 우리는 또한 핵의 경계에 관하여 각 네트워크를 대체 하는 방법을 개발. 이러한 도구는 연결 된 셀의 조사 네트워크에 대 한 다른 지역에 쉽게 적응 될 수 있다.

프로토콜

모든 절차는 건강 연구의 캐나다 학회 규칙에 의해 거주 하 고 몬트리올의 대학 동물 보호와 사용 위원회에 의해 승인 했다.

1입니다. 쥐 뇌 조각의 준비

1. 자당 기반 솔루션 (표 1)의 1 리터와 표준 인공 뇌 척추 액체 (실제) (표 2) 1 리터를 준비 합니다.
2. 95% O₂ , 5% CO₂ (carbogen) 30 분의 혼합으로 자당 기반 솔루션 솔루션 감기 하지만 하지 완전히 고정 될 때까지 약 30 분,-80 ° C에 그것을 배치 하기 전에 거품. 두뇌의 조각화에 대 한이 얼음 처럼 차가운 자당 절단 버퍼 사용 합니다. 냉동 고에서 제거 되 면 얼음에 그것을 유지.
3. 전체 실험을 통해 carbogen와 실제 거품. 이 솔루션을 사용 하 여 슬라이스 저장용 perfusing 버퍼는 패치 클램핑 및 이다의 biocytin 채우기 수행 됩니다. 최대한 빨리 그들은 잘라 두뇌 분할 입금 챔버를 들고 조각을 복구를 준비 합니다.
   참고: 슬라이스 복구 지주 챔버 주문 품 일 수 있고 실제, 튜브 아래쪽에서 carbogen 려 삽입으로 가득 큰 우물에 하단에 메쉬를 하나의 작은의 본질적으로 구성 되어.
4. 어떤 섹스 또는 스트레인 특정 편견 없이 15에 21-하루-오래 된 Sprague-Dawley 쥐를 사용 합니다. Isoflurane (1 mL의 마 취 유도 실에서 isoflurane)와 동물 anesthetize 부드럽게 뒷 발 또는 동물의 꼬리를 곤란 하 여 마 취의 깊이 확인 합니다.
5. 목을 벨 쥐를 단두대를 사용 하 여가 위, 그것의 두개골을 잘라 고 신속 하 게 편평한 주걱으로는 두개골에서 뇌를 제거.
6. 30 s 및 전송에 대 한 그것 (솔루션)에 페 트리 접시에 얼음 처럼 차가운 자당 기반 솔루션에서 뇌를 찍어. 면도기 칼 날 앞쪽 및 후부 영역으로 구분 되는 부분을 제거 절단 조각 가로 평면에서 경우.
7. 접착제의 rostral 측면에 뇌 조직의 나머지 블록 고 자당 기반 매체는 vibratome를 사용 하 여 뇌 조각 (350 µ m 두께)을 잘라 계속 합니다. 그런 다음 전송 챔버를 사용할 수 있을 때까지 실 온 (RT)에서 carbogenated 실제 가득 들고 복구에서 수집 된 조각 (복구에 최소 1 시간을 허용).
   참고: 필드에 최근 개발 허용 연장된 보육까지 체 외에서 뇌 조각의 24 h 조건¹⁷.

2. Sulforhodamine 101 (SR-101) 이다의 라벨

1. 34 ° C에 물 목욕 전 열 및 그것 두 슬라이스 보육 실 장소. 분할 영역 보육 실 1 μ M를 포함 하는 실제의 솔루션 작성 SR-101, 채울 다른만 실제.
2. 1 µ M를 포함 하는 인큐베이션 챔버에 슬라이스를 품 어 20 분 및 다음 전송 두 번째 외피에 그들 조직에서 초과 SR 101 개 린스 챔버 SR-101. 그것은 20 분 동안 품 어 또는 34 ° C에서 더 많은 다음 유지 때까지 RT에서 분할 영역을 포함 하는 인큐베이션 챔버 필요한¹⁸.

3. 사이토 패치 및 Biocytin 작성

1. 슬라이스를 선택 하 고 현미경의 녹음 실에서 그것을 배치. 패치 이다, 4-6MΩ 칼륨 구 루 콘-기반 솔루션으로 채워질 때의 저항 전극 사용 ( 표 3참조).
2. 시각적 지침과는 micromanipulator를 사용 하 여, 아래 그림 1에서 보듯이 한 SR 101 표시 된 사이토를 향해 기록 전극 직접. 이후 그들은 더 많은 가능성이 손상 되거나 인접 셀에 연결을 잃 었 조각의 표면에 있는 세포를 하지 마십시오.
3. Biocytin 조직에서의 누설을 방지 하기 위해 패치 피 펫에 추가 긍정적인 압력을 최소화 하 고 고칠 것 이다 사이토 가까이 하는 경우에 적용 (0.1-0.4 mL 1 mL 주사기에).
4. 패치 전에 피 펫의 커패시턴스의 간격 조정. 정확 하 고 정밀한 전압 명령을 중요 한 실험¹⁹액체 접합 잠재력에 대 한 수정.
5. 피펫으로 긍정적인 압력에 의해 발생 하는 우울증을 관찰 하는 사이토를 충분히 가까이 이동 합니다. 그런 다음, 긍정적인 압력을 제거 하 고 천천히 일부 부정적인 압력을 적용. 클램프-70에 사이토 mV 인감 100 m ω에 도달 하면. 인감에 1-3 GΩ를 도달할 때까지 기다립니다. 계속 셀에 침입까지 부정적인 압력을 적용. 때문에 이다 매우 연약한 부정적인 압력을 적용 하는 동안 주의 해야 합니다.
6. 기 워 진된 셀의 electrophysiological 속성을 평가 합니다. 전압 클램프 모드에서-120에서 110에 이르기까지 600 ms의 램프 전압 명령으로 전체 셀 전류-전압 프로토콜 수행 mV. 전류 클램프 모드에 있는 1000 밀리초 현재 단계 100 pA의-1에서 1 nA, 전체 셀 녹음의 샘플링 레이트의 주입은 10 kHz 단계 IV 프로토콜을 수행 합니다.
   참고: 이다 정류 ( 그림 1B에서 같이)의 어떤 종류 없이 막 도발은 (그림 1C)에 따라 발사 작업 잠재력 선형 전류-전압 프로필 표시. 휴식 막 잠재력 (RMP) 안정적이 고을-60mV 긍정 하지 해야 합니다. 어떤 뇌 영역에 이다의 RMP는 NVsnpr에서 보다 더 hyperpolarized입니다.
7. 단계 IV 프로토콜 마다 5 분을 수행 하는 동안 30 분 동안 사이토 내 확산 biocytin 허용.
8. 철회 및 패치 사이토를 손상 없이 패치 피 펫을 신중 하 게 분리 하 고 즉시 주의 피 펫의 오프셋의 녹음 실에서 그것을 복용 하기 전에. 막 잠재력 기록에서 해당 값을 뺍니다.
9. 뇌 조각을 결합 된 셀의 전체 네트워크에 패치 사이토에서 추적 프로그램의 확산을 허용 (이외에 주입을 위한 30 분) 15 분의 최소 녹음 실에서 나머지를 남겨 주세요.
   참고: 결합 된 세포의 네트워크를 공개, 단일 셀만 해야 패치 관심의 핵에서. 여러 시도가 성공적인 패치를 달성 하기 위해 필요한 경우, 경우 삭제 하 고 패치 contralateral 쪽 이나 다른 뇌 조각에 하려고 합니다.
10. 슬라이스 면을 위쪽으로 직면 하 고 식별 하는 조직에 마크 또는 절 개를 확인 하 고 4 %paraformaldehyde (PFA)의 솔루션으로 정상적인 실제를 포함 하는 배양 접시에 슬라이스를 먼저 전송. 4 ° C에서 슬라이스를 밤새 품 어.
    주의: PFA 매우 유해한입니다. 보호 장비를 사용 하 여 통풍 후드. PFA 접촉 된 모든 자료 (브러쉬, 튜브, 등) 복구 챔버, 보육 실, 또는 신선한 조직의 기록에 사용 하는 기타 자료를 들고 게 연락 하지 마십시오 확인 하십시오.

4. Biocytin 계시

1. 형광 streptavidine와 계시
   1. 워시 뇌 조각 2 x 10 분 0.1 M 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 실시간에 그런 다음 실시간에 4 h 4% 비 이온 세제로 PBS에서 1/200 희석에 fluorophore를 활용 하는 streptavidine와 함께 뇌 조각 잠복기는 biocytin 공개
   2. RT에서 0.1 M PBS에 뇌 조각 3 x 10 분을 세척 하 고 수성 설치 매체를 사용 하 여 유리 슬라이드에 섹션을 탑재. 위쪽으로 coverslip 주입 했다 측면 슬라이드에 놓고 손톱 광택 그들을 봉인.
2. DAB와 계시
   참고: 소량 (3, 3-diaminobenzidine) 계시는 형광을 사용할 수 없는 경우 사용할 수 있습니다. 이 경우에, 하나의 계시 방법 비교에 대 한 고용 해야 합니다.
   1. 뇌 조각 실시간에 PBS에 3 x 10 분 알을 품고 조각 PBS + H₂O₂ 0.5% 실시간에서 1 시간 동안 세척
   2. 실시간에 PBS에 조각 3 x 10 분을 씻어 그런 다음, 실시간 24 시간 PBS와 0.1% 비 이온 세제 + avidin 비타민 b 복합체 복잡 한 과산화 효소 표준 얼룩 키트 시 약 1/100의 구성 avidin 비타민 b 복합체 복잡 한 얼룩 솔루션에서 분할 영역을 품 어
   3. RT에 PBS에 3 x 10 분 슬라이스를 헹 구 십시오, PBS의 솔루션에 그들을 품 어 + RT에서 20 분에 대 한 0.05%를 소량 PBS의 솔루션으로 그들을 전송 + DAB 0.05% + H₂O₂ 0.5%.
      주의: 소량은 매우 해로운. 보호 장비를 사용 하 여 통풍 후드. 슬라이스는 PBS에 전송 될 때 색상 반응 중지 됩니다.
   4. RT에 PBS에 조각 5 x 10 분을 씻어, 유리 슬라이드 (얼굴 위쪽으로 주입 했다 측면)에 섹션을 마운트 슬라이드 벤치 34 ° c.에 하룻밤 건조에 말리 고
   5. 1 분 동안 크 실 렌의 목욕, 70%, 100%, 95%, 및 끝에 몇 가지 알코올 목욕에 1 분 동안 유리 슬라이드 잠수함
   6. 유리 슬라이드는 톨루엔 기반 합성 수 지 매체를 설치를 사용 하 여 탑재 합니다. Coverslips를 슬라이드에 놓고 손톱 광택 그들을 봉인.

5. 네트워크 영상

1. 스캐닝 confocal 현미경 20 X 4 X 목표 (또는 네트워크는 전체 핵을 시각화 하는 적절 한 목표)를 사용 하 여 astrocytic 네트워크 시각화는 fluorophore를 감지 하는 레이저 (이 경우에, 알 렉 사-594는 사용).
2. 20 배 확대를 사용 하 여 레이블이 지정 된 셀의 네트워크의 z 스택 수 있도록. 800 x 800 픽셀의 해상도 사용 하 고 스캔 속도 12.5 μ/픽셀의.
   참고: 전체 네트워크 이미지를 위해 여러 기반은 일반적으로 필요 하 고, 그리고 스택 수 각 네트워크에 대 한 조정 될 필요가 있다. 모든 데이터의 이미지를 동일한 설정을 사용 해야 하지만 볼 수 있듯이 해상도 및 스캔 속도 변경할 수 있습니다.
3. 4 배 확대를 사용 하 여 네트워크 및 관심 영역에의 이미지를 데리고.
   참고: 이미징 X 4는 관심의 핵 내 네트워크 위치를 결정 하는 데 사용 됩니다. 항상 이미지 전송된 빛에 동일한 필드. 공초점 형광 이미지에서 핵의 테두리를 확인할 수 없는 경우이 이미지는 유용할 것 이다.

6. 이미지 분석

1. 데이터 준비
   1. ImageJFIJI 소프트웨어를 사용 하 여 (https://fiji.sc/에서 다운로드). 파일을 "바이오 형식 가져오기 옵션" 창에서 확인을 클릭 합니다.
   2. Z-스택만 최종 z-스택 (그림 2A)에 필요한 광학 분할 영역을 포함 하는 재정의 하려면 도구 모음에서 "스택" 손잡이에 (찾을, 먼저 stk 선택 | Z 프로젝트)입니다. 프로젝션 유형 설정 (그림 2A)에서 "최대 강도"를 선택 합니다. 파일을 저장 하 고 이름을 "스택 파일".
   3. 이미지 파일에 여러 채널 있으면 astrocytic 네트워크 영상으로 채널만을 보존 하기 위해 그것을 분할 (이미지 | 컬러 | 채널 분할).
   4. 이미지의 픽셀 설정을 확인 [이미지 | 속성 | 픽셀 (픽셀 차원에 대 한 "1")와 함께].
   5. Subtract 배경 도구를 사용 하 여 (프로세스 | 배경 빼기) biocytin 라벨의 배경을 제거 하. 미리 보기 기능을 사용 하 여 일반적으로 50 픽셀 (그림 2B)에 설정 된 롤링 볼 반지름 설정.
   6. 제거 outliers 도구를 사용 하 여 (프로세스 | 소음 | Outliers를 제거) 빼기 배경 단계에 따라 필요한 경우. "어떤 Outliers" 설정 (그림 2C)에 "밝은"를 선택 합니다. 미리 보기 기능을 사용 하 여 반경 및 임계값 설정. 이후 그림 2D와 같이 그것은 데이터를 흐리게 수 있습니다이 도구와 함께 주의 해야 합니다.
      참고:이 도구는 (같이 그림 2B와 2c 에 흰색 화살표로 처리, 전후 각각) streptavidine의 불특정 예금으로 인 한 작은 반점 제거 됩니다.
   7. 임계값을 조정 (이미지 | 조정 | 임계값)입니다. "기본" 및 "B & W" 모드 (그림 2E)을 선택 합니다. "적용" 클릭 합니다.
      참고: 자동 조정 사용할 수 있습니다, 하지만 두 개의 슬라이더 막대를 사용 하 여 수동 조정 하는 것이 좋습니다. 이 단계의 목표는 소음을 줄이기 위해 최대 레이블이 지정 된 셀에 그대로입니다.
   8. 이진 프로세스 도구 바이너리 이미지 이미지 변환 (프로세스 | 이진 | 이진 하 게) 그림 2 층에 같이. TIFF 파일로 파일을 저장 하 고 이름을 "이진 파일".
2. 셀 계산
   1. 측정 기능 설정을 확인 (분석 | 설정 측정). "중심" 옵션을 선택 합니다.
   2. "이진 파일"에서 "입자 분석" 도구를 사용 하 여 이전 단계에서 (그림 3A) 생산 (분석 | 입자 분석) (왼쪽그림 3C ). "표시" 설정 (그림 3C)에서 "설명"을 선택 합니다. 이 탐지 (그림 3B)의 결과 표시 하는 새 파일을 생성 합니다.
   3. 매개 변수와 함께 재생: (만 셀을 검출 하려면 30과 6000 사이의 값을 사용 하 여) 크기와 순환 (사이의 간격을 결정 하 0 ~ 1는 "1"에서 완벽 한 원형 및 정의 "0" 임의의 모양) 탐지 (그림 3C, 왼쪽 부분)을 수정. "확인"을 클릭 하 여 검색을 실행 합니다.
      참고: 두 테이블 검색 다음 표시 됩니다: 각 셀 x 및 y 좌표를 제공 하는 1) 테이블 "요약" 제목 검색 된 셀의 수를 제공 하 고 2) "결과" (그림 3C, 오른쪽 부분) 라는 테이블.
   4. 값을 복사 하는 스프레드시트 응용 프로그램에 붙여넣을 합니다. 이름 "감지 테이블"에서이 테이블을 저장 합니다. 검색 된 셀의 음모와 파일 (그림 3B) 나타납니다. 이름 "검색 파일" TIFF 파일로이 파일을 저장 합니다.
   5. 분수령 도구를 사용 하 여 네트워크에서 2 또는 더 레이블 셀 그룹 분석 입자 도구 단일 셀 때문에 너무 가깝게 서로 게 감지 되 면 (프로세스 | 이진 | 분수령) 바이너리 이미지 분석 입자를 적용 하기 전에 도구를, 그리고 분석 입자 단계를 다시 실행.
      참고: 분수령 도구는 매우 가까운 셀 사이의 폭 1 픽셀의 한계를 만듭니다. 셀 카운터 플러그인 수 있는 라벨은 모호 하 고 수동으로 수행할 수 있습니다 때 사용.
3. Astrocytic 네트워크 영역 측정
   1. 네트워크의 표면적을 측정 하려면 제이 이미지를 사용 하 여 검색 파일
   2. 다각형 선택 도구를 선택 하려면 도구 모음에서 단추 (왼쪽된 클릭)를 사용 하 여 (그림 4A) 네트워크의 외부 주변에 있는 모든 셀을 연결 하는 다각형을. 왼쪽 다각형, 추적을 시작 하 고 그것을 마우스 오른쪽 단추로.
      참고:이 다각형 (ROI)의 지역으로 정의 됩니다 하 고 그것의 표면 네트워크의 표면 영역을 결정 하기 위해 측정 됩니다.
   3. 설정된 측정 창을 엽니다 (분석 | 측정 설정) 및 "영역" 옵션을 선택. 투자 수익 관리자 (분석 | 도구 | 투자 수익 관리자) (그림 4B). 다음, '추가 ' (그림 4B)를 클릭 하 여 추적된 다각형 투자 수익 관리자에서 추가 하 고 ROI 관리자에서 '측정'을 클릭 하 여 측정을 실행.
      참고: 영역 측정 테이블에 표시 됩니다 및 픽셀 단위로 표시 됩니다. Μ m²에서 값을 가져오는 데 사용 하는 현미경에 대 한 변환 인수를이 값으로 변환 하는 것을 잊지 마십시오.
4. 주요 방향 벡터의 결정
   1. 기 워 진된 셀의 결정
      1. ImageJFIJI에서 스택 파일을 열고 그것의 강한 라벨 강도 (그림 4C)에 따라 스택 파일에 패치 셀을 식별 합니다. 그런 다음 스프레드시트 응용 프로그램에서 "검색 표" 라는 파일 열고 패치 된 셀 및 해당 좌표에 관련 된 수 있습니다.
      2. 정확 하 게 패치 된 셀을 확인할 수 없습니다, 경우에 biocytin 예금 ImageJFIJI에서 다각형 도구를 사용 하 여 결합 된 셀의 이미지 네트워크에서 밀도가 지역 포위 하 고 패치 셀 (그림 4D)의이 위치 합니다.
      3. 투자 수익 관리자를 사용 하 여 (분석 | 도구 | 투자 수익 관리자)입니다. 그런 다음 패치 셀 위치에는 투자 수익을 그릴 하 고 ROI 관리자에 추가 ( 그림 4B참조).
      4. 설정 측정 (분석 | 설정 측정) 하 고 "중심" 옵션을 선택 합니다.
      5. 투자 수익 관리자에서 "측정" 추적된 지역의 중심의 좌표를 클릭. 이 좌표를 사용 하 여이 특정 네트워크에 대 한 참조 지점으로.
   2. 참조 번역
      1. 다음 수식을 사용 하 여 패치 사이토에 관하여 각 셀의 좌표를 계산.
          
         함께: 좌표로 주어진 셀; 패치 셀 (또는 네트워크의 참조 포인트);의 좌표로 그리고 으로 지정 된 셀에 새 참조에 대 한 좌표.
         참고: 패치 사이토에서 벡터 계산에 중요 한 단계는 패치 사이토에 관하여 각 셀의 좌표를 표현. 조심 하면 ImageJFIJI를 사용 하 여 모든 이미지에 대 한 참조는 이미지의 왼쪽 위 모서리에 있는.
   3. 우선 방향의 주요 벡터의 결정
      1. 다음 수식 사용 하 여 우선 방향의 기본 벡터의 좌표를 계산.
         
         함께: ()으로 우선 방향;의 기본 벡터의 좌표 그리고 는 패치 취득 네트워크의 각 셀의 좌표로 셀로 참조.
         참고: 네트워크에 있는 각 셀에 대 한 벡터 패치 사이토의 좌표를 기준으로 결정 됩니다. 우선 방향 네트워크의 주요 벡터는이 벡터의 합.
      2. 하나 (이후 패치 셀의 좌표 포함 되지 않습니다), 마이너스 네트워크에서 셀의 수에 나누어 (위의 수식을 사용 하 여에서 얻은 좌표에서 제공) 주요 벡터의 길이 값을 정규화 하 고 사이 비교를 사용 하 네트워크입니다. 이 분석의 회로도 보기는 그림 5에 표시 됩니다.
5. 관심의 핵에서 분석 된 네트워크의 배치
   1. 20 X 4 X 이미지의 맞춤
      1. (NVsnpr)의 핵에 있는 각 네트워크의 위치를 확인 하려면 4 X 이미지를 사용 합니다. 벡터 이미지 편집기로 4 X 이미지를 엽니다.
      2. 4 X 이미지를 선택 하 고 5로 그것을 곱하여 그 크기를 수정 합니다. 차원 창의 위쪽 가로 도구 모음의 오른쪽 부분에 위치 해 있습니다. 예를 들어, 800 x 800 픽셀 샘플링 되는 4 X 이미지, 4000 x 4000 픽셀 샘플링 해상도 변경 (픽셀 단위로 작업 단위를 설정로 이동 "문서 설정" 파일 탭: 파일 | 문서 설정)입니다. TIFF 형식 및 이름 그것 "크기 4 X" 파일을 내보냅니다.
      3. 어도비 일러스트 레이 터 문서의 왼쪽 아래 모서리와 이미지의 왼쪽 위 모서리를 맞춥니다.
         참고: 소프트웨어 왼쪽 하단 참조 지점에서 좌표를 제공합니다.
      4. 네트워크의 20 X 이미지를 엽니다. '바이너리 파일 ' 또는 '검색 파일 '을 사용 하 여 그들은 정렬 하기 쉽기 때문에. 다음, 다시 크기 4 X 정렬 20 X 이미지의 '이진 파일'에 불투명도 도구 함께 플레이 이미지.
         참고: 투명도 도구 최고 가로 도구 모음에는.
      5. 때 정렬이 완료 및 측정 도구가 나타납니다, 그래서 피 펫 도구를 잡고 선택한 왼쪽된 도구 모음에서 선택.
      6. 20 X의 좌표를 참조 20 X 이미지의 왼쪽 위 모서리에 클릭 하 여 측정 도구 크기 4 X에 포인트를 사용 하 여 이미지.
         참고: 라고 하는 20 X 참조 (20XR 그림5에서),이 좌표는 핵의 그리기 회로도에 각 네트워크의 위치를 표현 하는 데 유용 있을 것입니다.
   2. 관심의 핵의 정규화
      참고: 데이터를 요약, 사각형으로 핵 (NVsnpr)의 정규화가 사용 됩니다. 아래 단계를 설명 합니다.
      1. 오픈 4 X ImageJFIJI에서 파일 크기를 조정 하 고 다각형 도구를 사용 하 여 핵 (NVsnpr)를 둘러싸고. 사용 하 여 이미지 전송된 빛으로 핵의 테두리; 볼 수 수 없는 경우 어떤 경우에, 먼저 그것을 조정 기억 해요.
      2. 투자 수익 관리자 열고 그려진된 ROI를 추가 합니다. "설정 측정"에서 ' 경계 사각형 ' 옵션을 선택 합니다.
         참고: "경계 사각형" 옵션 그려진된 핵 주위에 작은 사각형을 계산합니다.
      3. "측정"을 클릭 합니다.
         참고: BX와 BY, 사각형의 왼쪽된 위 모퉁이의 좌표는 테이블이 나타납니다: ' 사각형 위치 ' 하 고 너비와 높이 제공 합니다. BX, BY 이라고 참조 하는 경계 사각형의 좌표는 및 .
   3. 정규화 된 핵에서 각 네트워크 위치 표현
      1. 각 셀 참조 X 4 (검은 사각형 그림5에서)의 좌표 표현 다음 수식을 사용 하 여:
         
         장소: 는 4 X 셀 좌표 참조; 는 20 X 참조 셀 좌표 (오렌지 광장 그림 5에서); 그리고 X 4 X 이미지 (20XR)에서 참조 포인트 20의 좌표.
      2. ( 그림 5의 파란색) 참조 하는 경계 사각형에 셀 좌표 표현 다음 수식을 사용 하 여:
         
         장소: 셀 참조; 하는 경계 사각형의 좌표는 는 X 4에서 셀 좌표 참조; 그리고 는 경계 사각형의 좌표 4 X 이미지에서 참조.
      3. 다음 수식을 사용 하 여 경계 사각형의 높이 폭의 비율을 참조 하는 경계 사각형의 셀 좌표 변환:
         
         장소: 셀 폭의 비율 및 높이 경계 사각형;의 좌표는 셀 참조; 하는 경계 사각형의 좌표는 프로토콜; 위에서 측정 하는 경계 사각형의 너비입니다 그리고 는 경계 사각형의 높이 측정 위의 프로토콜에.
      4. 같은 그림에 모든 네트워크를 표현 하기 위해 계정에 걸릴 슬라이스 (왼쪽 또는 오른쪽)의 방향. 데이터를 표준화 하는 참조에 적용 됩니다 슬라이스의 왼쪽. X 좌표에만 다음 수식을 적용 하 여 왼쪽 오른쪽의 네트워크 좌표를 전송:
         
         장소: 은 슬라이스; 오른쪽에 x 좌표 그리고  은 새로운 x 좌표 슬라이스의 왼쪽에는 참조에 표현.
         참고: 또는, 거울 분석 하기 전에 ImageJFIJI에 그림 (이미지 | 변환 | 뒤집기 수평으로).
      5. 우선 방향의 기본 벡터의 좌표 표현 하 셀 좌표 (단계 6.5.3.1 6.5.3.4)와 같은 단계를 수행 합니다.
         참고: 백분율로 좌표 식 있는 핵 (NVsnpr)은 사각형으로 설계 된 단일 플롯으로 데이터의 편집을 허용 한다.
6. 우선 방향 주요 벡터의 각도 차이의 연구
   참고: astrocytic 네트워크의 각도 차이 관심의 핵의 중심을 향해 우선 방향을 인지 확인 하는 데 사용 됩니다. ( 그림 5의 PD, 빨간 라인) 네트워크의 우선 방향의 주요 벡터와 c P를 연결 하는 선 사이의 각도 각도 차이 ( 그림 5의 α)를 계산 하려면 삼각형 PDC (참조로 알-카스 정리 적용 삽입 된 그림 5 의 보충 방법).
   1. 첫째, 직교 참조 사용 하 여 다음과 같은 방정식으로 피타고라스의 정리의 응용 프로그램을 사용 하 여 서로 다른 길이 계산:
      
      장소: P와 C의 좌표는 , , 각각, (위의 계산) 경계 사각형 참조에서.
   2. 다음 수식을 사용 하 여 라디안에서 각도 차이 확인 합니다.
      
   3. 도 (예를 들어, Excel 소프트웨어에서도 함수) 각도 차이 변환 합니다.
   4. 세로 막대형 차트 (그림 ℃ 및 7 D)에 그들을 그려서 모든 각도 차이 컴파일하고 astrocytic 네트워크의 우선 방향을 인지 확인 합니다.

결과

뇌에서 세포 간의 결합 정적 하지만 오히려 동적으로 많은 요인에 의해 규제 되지 않습니다. 다른 조건 하에서 공개 astrocytic 네트워크를 분석 하 고 NVsnpr에 그들의 조직을 이해 하기 설명 하는 방법 개발 되었다. 이러한 결과 출판된¹에 이미 있다. 우리는 세 가지 다른 조건에서 NVsnpr의 등 쪽 부분에 단일 이다 biocytin 작성 수행: 캘리포니아^{2 +}(제어 ...

토론

Electrophysiological 방법의 수 이다^23,24사이 결합 기능을 평가 하기 위해 존재 한다. 그러나,이 메서드는 astrocytic 네트워크의 해부학 적 배열에 대 한 정보를 제공 하지 않습니다. 많은 연구를 이미 그 "염료 또는 추적 프로그램-커플링", 다 여기, 발생의 일부분에만 electrophysiological 방법^25,26,27<...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Fisher Chemicals	S671-3
KCl	Fisher Chemicals	P217-500
KH2PO4	Fisher Chemicals	P285-500
MgSO4	Fisher Chemicals	M65-500
NaHCO3	Fisher Chemicals	S233-500
C6H12O6 Dextrose anhydrous	Fisher Chemicals	D16-500
CaCl2 dihydrated	Sigma	C70-500
Sucrose	Sigma	S9378
D-gluconic acid potassium salt	Sigma	G45001
MgCl2 anhydrous	Sigma	M8266
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E4378
ATPTris Salt	Sigma	A9062
GTPTris Salt	Sigma	G9002
Biocytin	Sigma	B4261
Carbenoxolone disodium salt	Sigma	C4790
avidin-biotin complex : ABC kit	Vestor laboratories	PK-4000
Streptavidine-alexa 594	Molecular Probes	S11227
Triton	Fisher Chemicals	BP151-500
Xylene	Fisher Chemicals	X5-1
Aqueous mounting medium 1 : Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Toluen-based synthetic resin mounting medium : Permount	Fisher Chemicals	SP15-100
Slide Drying Bench	Fisherbrand	11-474-470
Vibratome	Leica	VT 1000S
Microscope cover glass	Fisherbrand	12-544A
Microscope slide ColorFrost	Fisherbrand	12-550-413
PFA	Fisherchemicals	04042-500
Olympus FluoView FV 1000 Confocal microscope	Olympus
40X water-immersion lens	Olympus	LUMPLFLN40XW
20X water-immersion lens	Olympus	XLUMPLFL20XW
4X water-immersion lens	Olympus	XLFLUOR4X/340
Micropipette puller	Sutter Instrument	P97
Micromanipulator	Sutter Instrument	MP 225
Camera CCD	Sony	CX-ST50
Black and white monitor	Sony	SSM-125
Digidata	Molecular devices	1322A
Patch Clamp amplifier	Axon instrument	Mulitclamp 700A
Electrophysiology acquisition software	Molecular devices	pClamp 8
Electrophysiology analysis software	Molecular devices	Clampfit 8
Imaging analysis software	ImageJFIJI	Open source software. FIJI version including plug in package.
Vector image editor	Adobe	Illustrator CS4
Spreadsheet application	Microsoft Office	Excel 2010