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요약

이 프로토콜은 면역 종양학 연구를 위한 인간 면역 체계(HIS) 마우스의 생성을 간략하게 설명합니다. 이 모델에 이식된 인간 종양에 대한 인간 면역치료제를 시험하기 위한 이 모델의 사용에 있어서의 지침 및 고려사항은 종양에 대한 인간 면역계의 반응을 특성화하는 것에 중점을 두고 제시된다.

초록

종양 미세 환경의 면역 억제 특성을 역전시키는 것은 면역 요법 약물로 암을 성공적으로 치료하는 데 중요합니다. 쥐암 모델은 다양성이 극히 제한적이며 클리닉으로의 번역이 좋지 않습니다. 면역요법 연구를 위한 보다 생리학적인 전임상 모델 역할을 하기 위해, 이 프로토콜은 인간 면역계로 재구성된 마우스에서 인간 종양의 치료를 평가하기 위해 개발되었습니다. 이 독특한 프로토콜은 인간 면역계(HIS, "인간화") 마우스의 발달에 이어 세포주 유래 이종이식(CDX) 또는 환자 유래 이종이식(PDX)과 같은 인간 종양을 이식하는 것을 보여줍니다. HIS 마우스는 제대혈에서 분리된 CD34+ 인간 조혈 줄기 세포를 이종 종양도 수용할 수 있는 고면역 결핍 신생아 BRGS(BALB/c Rag2-/- IL2RγC-/- NODSIRPα)에 주입하여 생성됩니다. 인간 면역체계의 동역학 및 특성의 발달 및 종양 이식의 중요성이 강조된다. 마지막으로, 유세포 분석을 이용한 종양 미세 환경에 대한 심층 평가가 설명됩니다. 이 프로토콜을 사용하는 수많은 연구에서 개별 종양의 종양 미세 환경이 HIS-PDX 마우스에서 요약된다는 것이 밝혀졌습니다. "뜨거운" 종양은 큰 면역 침윤을 나타내지만 "차가운" 종양은 그렇지 않습니다. 이 모델은 광범위한 인간 종양에 대한 병용 면역 요법의 시험장 역할을 하며 개인화된 의학을 찾는 데 중요한 도구입니다.

서문

마우스 암 모델은 종양 성장 및 면역 탈출의 기본 메커니즘을 확립하는 데 중요합니다. 그러나 마우스 모델에 대한 암 치료 연구는 제한된 syngeneic 모델과 종 특이적 차이로 인해 임상에 유한한 번역을 산출했습니다 1,2. 종양을 제어하기 위한 지배적인 접근 방식으로 면역 요법의 출현은 기능적인 인간 면역 체계를 갖춘 생체 내 모델의 필요성을 반복했습니다. 지난 10년 동안 인간 면역계 마우스(HIS 마우스)의 발전으로 생체 내에서 매우 다양한 암 유형 및 면역치료제 3,4,5,6에서 면역종양학을 연구하는 것이 가능해졌다. 세포주 유래 및 환자 유래 이종이식 (각각 CDX 및 PDX)을 포함한 인간 종양 모델은 HIS 마우스에서 잘 성장하며, 대부분의 경우 인간 조혈 생착이 결여된 면역결핍 숙주에서의 성장과 거의 동일하다7,8. 이 주요 발견을 바탕으로 연구자들은 HIS 마우스 모델을 사용하여 면역 억제를 감소시키고 면역 유도 종양 사멸을 향상시키기 위해 종양 미세 환경(TME)을 변경하도록 설계된 병용 요법을 포함하여 인간 면역 요법을 연구해 왔습니다. 이러한 전임상 모델은 인간 암의 이질성 문제를 해결하는 데 도움이 되며, 치료 성공을 예측할 수 있을 뿐만 아니라 면역 관련 약물 독성을 모니터링할 수도 있습니다 9,10.

인간 조혈모세포의 도입을 통해 인간 면역계를 갖는 마우스 모델을 제작하기 위해서는 이종이식편을 거부하지 않는 수용자 면역결핍 마우스가 필요하다. 현재 HIS 마우스 모델은 30년 전에 보고된 면역결핍 마우스 균주에서 파생됩니다. 기술된 최초의 면역결핍 마우스 균주는 T 및 B 세포가 결여된 SCID 마우스였다11, 인간 CD47 분자12,13에 대한 NOD SIRPα 대립유전자에 대한 결합 증가로 인해 인간 세포에 대한 마우스 대식세포 내성을 담당하는 SIRPα 다형성을 갖는 하이브리드 NOD-SCID가 뒤따랐다. 2000년대 초반, BALB/c 및 NOD 면역결핍 균주 모두에서 IL-2 수용체(IL-2Rγc)의 공통 감마 사슬의 결실은 숙주 NK 세포 발달을 금지하는 유전자 결실로 인해 인간 생착 강화를 위한 게임 체인저였습니다14,15,16,17. BRG 및 NRG 마우스와 같은 대체 모델은 T 및 B 세포 수용체 유전자 재배열 및 림프구의 성숙 및 생존에 필요한 Rag1 또는 Rag2 유전자의 결실을 통해 T 및 B 세포 결핍을 달성한다18,19. 본원에 사용된 BRGS(BALB/c -Rag2 nullIl2RγCnullSirpα NOD) 마우스는 IL-2Rγ 사슬 결핍과 Rag2-/- 배경에NOD SIRPα 대립유전자를 결합하여 T, B 또는 NK 세포가 없지만 30주 이상의 장기 생착을 허용하기에 충분한 활력과 건강을 가진 고면역 결핍 마우스를 생성한다13.

HIS 마우스는 다양한 방식으로 생성될 수 있으며, 인간 PBMC 주사가 가장 직접적인 방법이다15,18,20. 그러나 이 마우스는 활성화된 인간 T 세포의 뚜렷한 확장을 가지고 있어 생후 12주까지 이식편대숙주병(GVHD)을 유발하여 장기 연구를 방해합니다. 대안적으로, 제대혈 (CB), 골수 및 태아 간으로부터의 인간 조혈 줄기 세포는 또한 인간 면역계의 생착 및 새로운 생산을 위해 사용될 수 있다. 이 시스템에서 조혈 줄기 세포는 대부분 T 세포를 발달시키는 PBMC 마우스에 비해 마우스 숙주에 중요하게 내성이 있는 T, B 및 선천성 면역 세포의 생성과 함께 다중 계통 인간 면역 체계를 생성합니다. 따라서 GVHD는 없거나 크게 지연되며 연구는 생후 10개월까지 마우스로 확장될 수 있습니다. CB는 유전적으로 동일한 면역계를 가진 다수의 HIS 마우스의 생착을 용이하게 하는 CD34+ 인간 조혈 줄기 세포의 용이하고, 접근하기 쉽고, 비침습적인 공급원을 제공한다 17,18,20,21. 지난 몇 년 동안, HIS 마우스 모델은 면역요법 및 TME 3,4,5,6을 연구하기 위해 광범위하게 사용되어 왔다. 이들 마우스에서 인간 유래 면역계의 발달에도 불구하고, 인간 이종이식 종양은 대조군 면역결핍 마우스와 유사한 속도로 성장하고, 암세포와 면역 세포 사이의 복잡한 상호작용을 허용하며, 이는 생착된 PDX 3,7,8의 미세환경을 유지하는 데 중요하다 . 이 프로토콜은 PDX 및 CDX가 있는 HIS-BRGS 마우스에서 치료를 테스트하는 50개 이상의 연구를 수행하는 데 사용되었습니다. 중요한 결론은 HIS 마우스의 인간 종양이 초기 환자 샘플 및 면역 침윤 특성에 대한 종양의 분자 평가에 의해 정의된 바와 같이 그의 독특한 TME를 유지한다는것이다 3,22,23. 우리 그룹은 다중 매개변수 유세포 분석을 사용하여 면역 기관과 종양 모두에서 HIS에 대한 심층 평가에 중점을 둡니다. 본원에서, 우리는 BRGS 마우스의 인간화, 키메라즘의 평가, 인간 종양의 이식, 종양 성장 측정, 암 치료 투여, 및 유세포 분석에 의한 HIS 세포의 분석을 위한 프로토콜을 기술한다.

프로토콜

모든 동물 작업은 콜로라도 대학교 덴버 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC 프로토콜 #00593 및 #00021)에서 승인한 동물 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 모든 동물 작업은 콜로라도 대학교 덴버 안슈츠 메디컬 캠퍼스에 있는 미국 실험동물 관리 협회(American Association for Laboratory Animal Care)의 공인 시설인 OLAR(Office of Laboratory Animal Resources)에 따라 수행되었습니다. 모든 인간 제대혈 샘플은 신원이 확인되지 않은 기증자로부터 기증으로 얻었으므로 인간 연구 윤리 위원회의 승인을 받지 않습니다.

참고: 프로토콜에 언급된 모든 미디어 및 솔루션의 구성은 보충 파일 1에 포함되어 있습니다. 도 1 은 HIS-BRGS 마우스에서 종양에 대한 면역 반응의 생성 및 분석을 위한 전체 프로토콜을 예시한다.

1. HIS 마우스의 생성

  1. BALB/c -Rag2 null Il2RγCnull SirpαNOD(BRGS) 마우스의 마우스 축산
    참고: 이 균주는 T, B 또는 NK 세포가 없는 극도로 면역결핍적입니다. 따라서 기회 감염을 예방하기 위해 엄격한 조치를 취해야 합니다. trimethoprim과 sulfadiazine을 함유 한 식단을 정상적인 식단과 2 주 일정으로 번갈아 가며 식민지를 유지하십시오. 가능한 한 가장 높은 수준의 예방 조치 수용실(예: 접근이 제한된 배리어 샤워 시설)을 유지하십시오.
    1. BALB/c -Rag2 null Il2RγC null Sirpα NOD(BRGS) 및 BALB/c Rag2 null Il2RγCnull SirpaBalb/c(BRG) 동형접합 마우스의 콜로니를 육종가로 유지합니다.
    2. BRGS N/N×BRG B/B를 번식시켜 인간 줄기 세포의 수용자로 사용할 BRGSB/N 새끼를 생성합니다. 이 군체에서 BRGSB/N은 BRGS N/N보다 건강하고 생착은 동등한 수준(BRG 이상)입니다.
  2. 제대 CB에서 CD34+ 인간 줄기 세포 분리
    참고: 이 절차에는 항생제가 사용되지 않습니다. 따라서 좋은 멸균 기술이 필수적입니다.
    1. 50mL 원뿔형 튜브 랙과 3x 15mL 및 ~10x 50mL 원뿔형 튜브를 멸균된 생물안전 캐비닛(BSC)에 넣습니다. 채혈 백에 70% 에탄올을 뿌리고 BSC에서 건조시킵니다.
    2. CB 밀도 구배 분리에 필요한 50mL 원뿔형 튜브의 수 = CB 부피/15를 반올림하여 짝수 튜브 번호로 계산합니다. 튜브당 혈액량 = CB 부피/튜브 수를 계산합니다. CB 백에서 각 원추형 튜브에 혈액을 조심스럽게 붓습니다. 튜브당 최대 15mL입니다. 자동 피펫터와 25mL 혈청학적 피펫을 사용하여 위아래로 피펫팅하여 혈액을 멸균 PBS와 1:1로 혼합합니다.
    3. 저속 자동 피펫과 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 계면을 방해하지 않고 실온(RT) 1.077g/mL 밀도 구배 용액( 재료 표 참조)으로 혈액을 천천히 밑받침합니다. 피펫 팁이 튜브 바닥에 닿지 않도록 하십시오. 모든 튜브에 대해 반복합니다. 그런 다음 밀도 구배를 유지하기 위해 RT에서 제동 없이 850 x g에서 30분 동안 원심분리합니다.
    4. 1.077g/mL 밀도 구배 위에 있는 세포 버피 코트를 흐린 흰색 층으로 시각화합니다. 25mL 혈청학적 피펫과 자동 피펫터를 사용하여 버피 코트 위 약 10mL까지 혈장층을 제거하고 버립니다.
    5. 멸균 이송 또는 혈청 학적 피펫으로 버피 코트를 수집하십시오. 주걱처럼 피펫을 사용하여 원뿔형 튜브의 측면에서 세포를 긁어내고 전구를 풀어서(또는 천천히 피펫팅) 세포를 끌어올립니다. 두 개의 50mL 코니컬 튜브의 버피 코트를 하나의 새로운 50mL 코니컬 튜브로 결합합니다.
    6. 2% FBS를 함유한 멸균 HBSS 45mL를 각 원뿔형 튜브에 부어 세포를 세척합니다. RT에서 360 x g 에서 11분 동안 원심분리기.
    7. 세척 매체를 모든 튜브의 펠릿까지 흡입합니다. 10mL 혈청학적 피펫과 자동 피펫을 사용하여 2% FBS를 함유한 HBSS 10mL에 첫 번째 펠릿을 재현탁합니다. 동일한 HBSS 10mL에 각 펠릿을 재현탁하고 추가 10mL의 HBSS로 각 튜브를 헹구어 모든 세포를 단일 튜브에 수집합니다.
    8. 2% FBS가 포함된 멸균 HBSS 45mL를 원뿔형 튜브에 붓습니다. 360 x g, 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
    9. 세척 완충액을 세포 펠릿으로 흡인하고 펠릿을 20mL의 자기 세포 분리기 완충액에 재현탁합니다( 재료 표 참조). 작은 부분 표본을 제거하여 메틸렌 블루에서 1:20 희석으로 혈구분석기로 세포를 계산합니다. 파란색과 흰색 셀의 수를 더합니다. 360 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
      알림: 이 프로토콜은 마그네틱 비드 기술을 사용합니다( 재료 표 참조). 이 프로토콜은 CD34+ 줄기 세포의 충분한 순도와 수율로 모든 세포 분리 기술과 함께 사용하도록 변형될 수 있습니다.
    10. 상층액을 흡인하고 제대혈에서 분리된 CD34+ 세포 펠릿을 1 x 10 8개 세포당 300μL의자기 세포 분리 기 버퍼에 재현탁합니다. 먼저 100 μL의 FcR 차단 시약을 첨가한 다음, 1 x 108 세포당 100 μL의 CD34+ 마그네틱 비드를 첨가한다. 4°C에서 30분 동안 배양합니다(얼음 없음).
    11. 1 x 108 셀당 5 mL의 자기 세포 분리기 버퍼를 추가하고 4°C에서 10분 동안 360 x g 로 회전합니다. 세척 단계를 반복하고 "미분획"이라고 표시된 15mL 원뿔형 튜브에 1 x 108 개 세포당 500μL의 자기 세포 분리기 버퍼에 펠릿을 재현탁합니다.
    12. 두 개의 15mL 원뿔형 튜브 "CD34-" 및 "CD34+"에 레이블을 붙입니다. 3개의 15mL 원뿔형 튜브(비분획, CD34- 및 CD34+)를 냉각 랙의 슬롯 A1, B1 및 C1에 각각 놓습니다( 재료 표 참조). 제조업체의 기기 지침에 따라 BSC의 자동 자기 셀 분리기( 재료 표 참조)에서 2열 양성 선택 프로그램을 사용하여 셀을 분리합니다.
  3. CD34+ 인간 줄기 세포 확장 및 동결
    1. 회수된 CD34+ 세포 현탁액(2mL)을 혈구계 슬라이드에 10μL씩 분취하고 10배 배율로 세포를 계수합니다. 세포 수에 2 x 104를 곱하여 CD34+ 세포의 총 수를 계산합니다. 총 CD34+ 세포 수를 250,000으로 나누어 동결할 바이알의 수를 계산합니다( 시험관 내 확장 전 마우스 강아지당 50,000개 세포).
    2. 40ng/mL 줄기 세포 인자, 20ng/mL Flt3L 및 10ng/mL IL-6이 보충된 CB 배지 Iscove의 10% FCS(추가 1mL 여과 손실 포함)를 준비하고 0.22μm 필터를 통과시킵니다. CD34+ 세포를 CB 배지 mL당 100,000에서 재현탁하고, 37°C에서 인큐베이션한다. 3일째에, 사이토카인이 없는 동등한 부피의 CB 배지를 세포와 사이토카인이 있는 CB 배지를 함유하는 플라스크에 첨가한다.
      참고: 이러한 사이토카인을 CB 배지에 첨가하면 분화를 방지하면서 CD34+ 세포의 생존과 확장을 촉진합니다.
    3. 5일째에 확장된 CD34+ 세포를 수확합니다. 세포 현탁액을 위아래로 피펫팅하고 50mL 원뿔형 튜브에 수집합니다. 플라스크 바닥을 덮을 수 있도록 충분한 CB 매체를 추가합니다. 셀 스크레이퍼를 사용하여 플라스크의 바닥 전체를 긁어냅니다. 모든 배지를 동일한 50mL 튜브에 모으고 360 x g 에서 11분 동안 원심분리합니다.
    4. 세포를 2mL의 CB 배지에 재현탁합니다. 계수를 위해 피펫의 최종 방울을 96웰 플레이트에 저장합니다. 세포를 트리판 블루로 1:1로 희석하고 혈구분석기에 10μL를 추가한 다음 4사분면에서 세포 수를 세고 평균을 냅니다. 세포 수에 4 x 104를 곱하여 CD34+ 세포의 총 수를 계산하고 생존율을 기록합니다.
    5. n+1mL의 냉동 배지를 만들고, 여기서 n은 1.3.1단계에서 계산된 냉동 바이알의 수입니다. FBS에 10%(v/v) DMSO를 첨가하여 동결 매체를 준비하고 얼음 위에 보관하십시오. 극저온 액체에 CB#, CD34+ d5 및 날짜로 라벨을 붙입니다.
    6. CD34+ 세포를 4°C에서 10분 동안 360 x g 로 스핀다운합니다. 배지를 펠릿까지 흡인하고 세포 펠릿을 동결 배지에 재현탁합니다. 1mL의 세포 현탁액을 각 바이알에 분취하고 나머지는 바이알 사이에 균등하게 나눕니다. 바이알을 4°C로 냉각된 이소프로판올 셀 냉동고에 추가하고, -80°C에 두고, 액체 질소로 옮겨 >90일 동안 보관한다.
  4. 쥐 새끼의 조사
    1. 출생 후 1-3일 후에 BRGSB/N 새끼를 패딩이 있는 고압 증기 멸균 플라스틱 상자에 수집합니다. 새끼와 함께 소량의 침구를 추가하십시오. 상자에 케이지 번호와 새끼 수를 표시하십시오.
    2. 300rad의 선량에 대해 방사선 조사기( 재료 표 참조)를 설정합니다. 새끼 상자를 조사 장치에 넣고 300 rad에 노출시킵니다. 새끼를 새장으로 다시 데려가 더미에 넣고 침구로 덮습니다.
  5. 강아지 주사 및 CD34+ 세포 준비
    1. 방사선 조사 후 ~3시간 후에 CD34+ 세포 준비를 시작합니다. 50mL 원뿔형 튜브에 10mL의 CB 배지를 예열합니다. 멸균 BSC에서 모든 단계를 수행합니다.
    2. 주사할 새끼 4-6마리마다 시험관 내 확장 및 냉동 CD34+ 세포 바이알 1개를 회수합니다. 소량의 얼음이 보일 때까지 55 ° C에서 빠르게 해동하고 세포를 따뜻하게 한 CB 배지에 첨가하십시오 (바이알은 여전히 차가워 야합니다). 1mL의 배지를 사용하여 각 바이알을 헹구고 4°C에서 12분 동안 360 x g 에서 세포를 회전시킵니다.
      참고: 55°C에서의 빠른 해동은 37°C에서 해동하는 것보다 더 나은 세포 생존율(90%-95%)을 산출하는 것으로 밝혀졌습니다.
    3. 매체를 조심스럽게 흡인하십시오. (작은) 펠릿을 2mL의 CB 배지에 재현탁하고 부드럽게 혼합한 다음 ~30μL의 세포 현탁액을 계수 플레이트의 단일 웰에 추가합니다. 트리판 블루에서 1:1로 희석한 다음 혈구계에 10μL를 넣고 4사분면에서 세포를 계수하고 평균을 구합니다.
    4. 세포 수에 4 x 104 를 곱하여 CD34+ 세포의 총 수를 계산한 다음 생존율을 기록합니다. 4°C에서 360 x g 로 12분 동안 회전합니다.
    5. 배지를 조심스럽게 흡인하고 n+1 새끼당 멸균 PBS 100μL에 세포 펠릿을 재현탁하여 주입하여 마우스당 250,000-450,000개의 CD34+ 세포를 생성합니다. 원뿔형 튜브를 운송 용기의 얼음 위에 놓고 강아지 주사를 위해 동물 사육장으로 이동합니다.
    6. 열 램프, 기저귀, 1mL 주사기, 18G 바늘, 30G 바늘 및 CD34+ 세포 제제를 멸균 용기에 담아 동물 사육장 BSC로 가져옵니다. 멸균 기저귀를 열 램프 아래 ~2피트 아래에 놓습니다. 주입할 깔짚이 있는 케이지를 회수하여 BSC에 넣습니다.
    7. 18G 경사진 바늘로 주사기를 조립합니다. 원추형 튜브의 각도와 바늘의 경사를 일치시켜 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하고 끌어 올립니다. 강아지를 기저귀에 올려 따뜻하게하십시오 (과열 주의). 주사기에서 공기를 제거하고 18G 바늘을 30G 바늘로 교체한 다음 세포 현탁액이 바늘 끝에 올 때까지 주사기를 조심스럽게 밉니다.
      참고: 또는 인슐린 주사기를 사용할 수 있습니다.
    8. 한 번에 한 마리의 강아지를 열 램프에서 떨어진 기저귀 가장자리로 데려가십시오. 엄지와 집게 손가락 아래에 강아지를 옆으로 고정시켜 얼굴을 선명하게 볼 수 있도록합니다. 귀가 있을 곳 아래 뺨을 가로지르는 정맥에 주목하십시오. 눈에 가장 가까운 정맥(IV)에 바늘을 얕게 삽입하고 세포 50μL를 천천히 주입합니다.
    9. 피하 주사로 기포가 형성되는지 확인하십시오. 그렇다면 바늘을 더 깊숙이 삽입하고 세포 주입을 진행하십시오. 성공하면 작은 혈액 / 혈종이 보입니다.
      참고: 강아지 주사에 관한 Gombash Lampe et al.24 의 절차를 참조하십시오.
    10. 강아지가 아직 고정된 상태에서 또 다른 50μL의 세포(IV+IH의 강아지당 총 100μL)로 간내 주사(IH)를 수행합니다. 간은 흰 우유 밴드와 흉부 케이지 사이의 어두운 점으로 시각화 할 수 있습니다. 주사되지 않은 강아지와 열에서 더 멀리 떨어진 기저귀에 주사 된 강아지를 놓습니다.
      참고: IV 주사는 IH 주사 단독보다 장기적으로 더 나은 키메라를 나타내지만25, IV 주사가 항상 성공적인 것은 아니다. 따라서 IV와 IH 사이에 주사를 분할하면 더 많은 비율의 마우스에 생착이 보장됩니다.
    11. 모든 새끼에 대해 안면 정맥과 IH 주사를 모두 반복하십시오. 피를 닦아내고 새끼를 새장에 있는 둥지로 돌려보내고 침구로 덮습니다.

2. 혈액에서 인간의 키메라 테스트

  1. 10주령 및 14주령 모두에서 HIS 마우스의 혈액에서 키메라를 테스트합니다. 안와후정맥을 통해 또는 IACUC에서 승인한 대체 방법을 사용하여 50μL의 혈액을 수집합니다.
    1. retro-orbital bleeds의 경우, 이소플루란 기화기를 5로 설정하여 1-2분 동안 마우스를 마취시킨 다음 기화기 설정을 4로 낮춥니다. 마우스가 마취 상태에서 충분한 산소를 공급할 수 있도록 필요에 따라 기화기를 낮추십시오. 마우스를 이소플루란 아래에 5분 이상 두지 마십시오.
    2. 마취된 마우스의 코를 이소플루란 기화기 노즈콘 부착물에 넣고 진통제(0.5% 프로파라카인 HCl 점안액 USP)를 눈에 떨어뜨립니다.
    3. 1분 후, 멸균 거즈를 사용하여 프로파라카인을 제거하고, 눈을 프로토즈하고, 75mm 헤파린화된 헤마토크릿 튜브를 안와방향으로 역방향으로 삽입하여 50μL의 혈액을 수집합니다. 50μL의 헤파린이 들어 있는 1.5mL 미세분리기 튜브에 혈액을 배출하고 부드럽게 혼합합니다.
    4. 출혈을 멈추고 프로 파라 카인 한 방울을 바르기 위해 멸균 거즈로 눈을 감았습니다. 이소플루란에서 마우스를 제거하고 깨끗한 케이지에서 회복합니다.
  2. 마우스 혈액에서 PBMC 분리
    1. 혈액/헤파린을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합하고 계면을 방해하지 않도록 주의하면서 1.077g/mL 밀도 구배 500μL 위에 천천히 오버레이합니다. 브레이크 없이 RT에서 1,220 x g 에서 20분 동안 튜브를 원심분리합니다.
    2. 세포 버피 코트를 혈장 아래의 1.077g/mL 밀도 구배 위에 흐린 층으로 시각화합니다. 200 μL 피펫을 사용하여 버피 코트에서 가능한 한 많은 세포를 제거하고 750 μL의 수확 배지가 들어 있는 새로운 1.5 mL 튜브에 추가합니다. RT에서 360 x g 에서 11분 동안 원심분리기.
    3. 배지를 50 μL까지 흡인하고 750 μL의 수확 배지에 펠릿을 재현탁합니다. 4°C에서 10분 동안 360 x g 에서 원심분리하고, 다시 50 μL로 아래로 흡인한다. 세포는 표면 염색에 재현탁될 준비가 되었습니다.
  3. 표면 염색 및 유세포 분석
    1. 염색 패널 워크시트를 작성합니다(표 1; "Spectral flow bleed panel" worksheet)를 마우스 번호로 염색하고, 모든 형광 항체를 염색 완충액에 첨가하여 항체 염색 칵테일을 제조한다(보충 파일 1). 플레이트 레이아웃을 만들어 샘플을 96웰 U자형 바닥 플레이트에 추가합니다. 영구 마커를 사용하여 우물의 바닥을 표시하십시오. 적절한 농도를 결정하기 위해 염색 전에 표준 절차를 사용하여 항체를 적정한다26.
    2. 62μL의 표면 염색 칵테일을 96웰 U자형 바닥 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 튜브에 남아있는 50 μL의 세포를 재현탁하고 각 샘플을 해당 웰에 추가합니다. 양성 염색을 위한 웰(인간 PBMC + 마우스 비장세포, 각각 1 x 106 세포)을 샘플과 함께 염색하기 위해 포함시켰다. 피펫팅으로 혼합하고 4°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.
    3. 4°C에서 3분 동안 680 x g 로 원심분리합니다. 플레이트를 싱크대에 넣어 상층액을 제거하고 ~10x 부드럽게 피펫팅하여 150μL의 염색 완충액에 재현탁하여 세포를 세척합니다. 각 웰을 150 μL의 염색 완충액에 스핀 및 재현탁합니다.
    4. 유세포 분석기에서 각 샘플의 100μL에 대한 데이터를 수집하고( 재료 표 참조) .fcs 파일을 내보냅니다. .fcs 파일을 흐름 데이터 편집 소프트웨어로 가져옵니다( 재료 표 참조). 세포를 둘러싼 FSC-A x SSC-A 플롯에 폴리곤 게이트를 적용하고 파편을 제외합니다. 게이트 내의 셀을 선택합니다( 표 1; "Spectral Flow Bleed Gating" 워크시트).
    5. 축을 (FSC-A x FSC-H)로 변경하고 선에서 돌출된 이중선을 제외하고 선형 대각선에 포함된 셀을 게이트합니다. 이 셀을 선택하고 축을 (hCD45 x mCD45)로 변경합니다.
    6. hCD45+ 모집단에 폴리곤 게이트를 적용하고 "human"이라는 이름을 적용합니다. mCD45+ 모집단에 폴리곤 게이트를 적용하고 이름 "mouse"를 적용합니다. 인간 모집단과 마우스 집단 모두에 대한 카운트 통계를 생성합니다.
    7. 인간 모집단을 선택하고 좌표축을 (CD19 x CD3)로 변경합니다. CD19+ 셀에 폴리곤 게이트를 적용하고 이름을 "B 셀"로 지정합니다. CD3+ 모집단에 다각형 게이트를 적용하고 이름을 "T 세포"로 지정합니다. 이중 음수 모집단에 다각형 게이트를 적용하고 이름을 "NonTB"로 지정합니다.
    8. T 세포 집단을 선택하고 축을 (CD8 x CD4)로 변경합니다. CD4 및 CD8 양성 모집단에 다각형 게이트를 적용하고 각각 "CD4+" 및 "CD8+"로 이름을 지정합니다.
    9. NonTB 모집단을 선택하고 축을 (CD56 x myeloid)로 변경합니다. 이중 양성 사건을 포함한 총 CD56 양성 집단에 다각형 게이트를 적용하고 이름을 "NK 세포"로 지정합니다. CD56 음성 및 골수 양성 집단에 다각형 게이트를 적용하고 이름을 "myeloid"로 지정합니다.
    10. 모든 모집단의 백분율 및 개수 통계에 대한 표를 만들고 스프레드시트 소프트웨어로 내보냅니다( 재료 표 참조). %hCD45 키메라 = %hCD45/(%hCD45 + mCD45)를 계산합니다.
    11. 추가 실험을 위해 <20% hCD45+(mCD45+hCD45)인 HIS 마우스를 제외한다.
      참고: 이 연구에서 PBMC는 더 깨끗한 RBC 고갈을 위해 1.077g/mL 밀도 구배 분리를 사용하여 준비되었습니다. 이 절차는 PBMC 층으로부터 인간 및 마우스 과립구를 배제하였다. 대안적으로, RBC 용해가 사용될 수 있다.

3. 생쥐에 종양 주입

  1. 종양 주입 전에, 14주 출혈 데이터로부터 T 세포 수를 확인한다. T 세포가 >20%인 경우 20-26주 사이, T 세포가 전체 면역 세포 집단의 <20%인 경우 24-28주 사이에 수확할 준비가 되도록 종양을 주입합니다. 이 주사 타이밍은 마우스가 20-28주령이고 연구 종료 시 충분한 수의 T 세포를 갖도록 합니다.
  2. 세포주 유래 이종이식(CDX) 주입
    참고: 절차는 MDA-MB-231 유방 선암 세포( 재료 표 참조)를 예로 사용하여 설명합니다.
    1. 냉동 세포의 분취량을 해동하고, 10% FBS, 1% PenStrep 및 1% 비필수 아미노산이 보충된 10mL의 DMEM에 재현탁하여 1x 세척하고, 4°C에서 10분 동안 360 x g 에서 원심분리한다. 배지를 흡인하고 T25 플라스크에서 10% FBS, 1% PenStrep 및 1% 비필수 아미노산이 보충된 10mL의 DMEM에 재현탁하고 5%CO2와 함께 37°C에서 배양합니다.
      참고: 세포주는 올바른 세포 유형을 보장하기 위해 PCR에 의해 인증됩니다. 세포 상층액은 주입 전에 생화학적 분석을 통해 마이코플라스마에 대해 테스트됩니다.
    2. 계대배양 및 지수 성장기 동안 세포를 약 80% 합류성으로 확장시킨다.
      1. 배지를 흡인하고, 5-10 mL의 멸균 PBS (pH 7.2)로 세포를 헹구고, 세포가 플라스크로부터 분리될 때까지 1 내지 5 분 동안 0.25% 트립신-EDTA 1 mL와 함께 배양한다.
      2. 동일한 DMEM 5mL를 넣고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 전체 6 mL의 세포 현탁액을 새로운 조직 배양 처리된 T75 플라스크(1:3 희석)에 통과시키고, 10 mL의 DMEM을 추가로 첨가한다.
      3. 세포를 DMEM에서 1:3 희석 도금에서 80% 밀도로 2-3일마다 계대시켜 세포를 확장시킵니다.
    3. 6 계대 내에서 지수 성장 단계 동안 0.25% 트립신-EDTA로 세포를 수확하고 PBS로 세척합니다. PBS와 기저막 추출물( 재료 표 참조)을 1:1 비율로 혼합하고 최종 농도 5 x 107 cells/mL로 세포에 추가합니다.
    4. 단계 2.1.1에 설명된 대로 마우스를 이소플루란으로 마취합니다. 23G 바늘을 사용하여 100μL(5 x 106 개 세포)의 종양 세포 현탁액을 각 옆구리에 피하 주사합니다.
  3. 투관침을 사용하여 환자 유래 이종이식(PDX) 주사를 수행합니다. PDX 모델에 대한 주입 절차 및 기타 개발 및 유지 관리 지침은 문헌27에서 확인할 수 있습니다.

4. 종양 성장 측정

  1. 이식 후 일주일에 한 번 종양 성장을 위해 옆구리를 따라 느끼면서 종양 진행을 확인합니다. 종양이 만져지면 이소 플루 란 (2.1.1 단계에서 설명한대로)으로 마우스를 마취시키고 종양이 자라면서 궤양을 예방하기 위해 종양 주위를 돌보면서 전기 트리머로 각 측면을 면도합니다.
    참고: 종양 주위의 피부 손상을 방지하기 위해 종양 주사 전에 마우스를 면도할 수 있습니다. 그러나 모발 재성장 속도는 종양 측정을 방해할 수 있습니다.
  2. 캘리퍼스를 사용하여 일주일에 두 번 종양의 길이와 너비를 측정하고 측정값을 mm 단위로 기록합니다. 종양 측정값을 다음 공식figure-protocol-12465을 사용하여 종양 부피(mm3)로 보고합니다. 종양 부담이 단일 종양 당 2,000 mm3 또는 3,000 mm3의 결합 부피를 초과하지 않도록주의하십시오.
    참고: 암 연구에서 마우스 사용에 대한 지침은 지역에 따라 다릅니다. 연구기관의 동물 관리 및 사용 정책을 참조하십시오.

5. 약물 치료

  1. HIS 마우스를 hCD45 키메라, hCD3 키메라, 및 hCD8 키메라에 기초한 동등한 처리 그룹에 할당한다. 종양이 평균 100mm3에 도달하면 약물 치료를 시작하십시오.
    참고: 그룹당 마우스의 수는 CB로부터 생성된 HIS 마우스의 수를 기준으로 합니다. 그룹당 최소 4마리의 마우스를 사용하는 것이 좋습니다. 비-이분법 다집단 매칭(예를 들어, R-vivo 마닐라 소프트웨어에서)은 이러한 집단화에 유용하다(28).
  2. 약물 경로 및 빈도
    1. 항-PD-1 억제제(니볼루맙, 펨브롤리주맙)를 30mg/kg 주당 1회 또는 20mg/kg 1회 단독 치료 또는 10-15 mg/kg 주당 2회 병용 치료.
    2. 표적 요법, 화학 요법 및 방사선 조사와 같은 병용 요법을 실험 설계에 따라 투여합니다. 표적 요법 및 화학 요법은 경구 위관영양, IP 주사 또는 음식을 통해 제공될 수 있습니다.
      참고: 용량은 공개된 데이터 및 종양 모델에 따라 다양하고 최적화될 수 있습니다. 용량 연구는 종종 HIS 마우스 연구 전에 면역 결핍 수용자에서 테스트됩니다.
  3. 체중 감소, 느슨한 대변, 구부러진 자세, 이동성 감소 및 모피 손실과 같은 건강 변화에 대해 일주일에 최소 3번 마우스를 모니터링합니다. 일부 증상은 약물 독성 또는 GVHD의 징후일 수 있으며 약물 투여를 줄이거나 중단해야 할 수 있습니다. 동물 관리 및 사용 정책에 따라 필요에 따라 마우스를 안락사시킵니다.

6. 연구 종료 시 마우스 조직 및 종양 채취

  1. 기관 및 수의학 지침에 따라 2.75L/min의 유속으로 압축된CO2 가스를 사용하여 마우스를 단독으로 안락사시킵니다. 사망 후 1분 동안CO2 에 보관된 마우스를 모니터링한 다음 안락사의 2차 형태로 자궁경부 탈구를 수행합니다.
  2. 채혈
    1. 심장 내 천자를 통해 혈액을 수집합니다. 마우스를 똑바로 세운 상태에서 25G 바늘이 달린 1mL 주사기를 정중선 바로 왼쪽과 갈비뼈 아래 선에서 심장에 직접 삽입합니다. 이상적으로는 한 번의 긴 드로우를 통해 주사기에 혈액을 수집하고 라벨이 붙은 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
      참고: 추가 바늘 삽입을 수행하여 폐강 모서리에서 추가 혈액을 조심스럽게 수집할 수 있습니다.
    2. 혈액을 4°C에서 1시간 동안 방치한 다음 7,800 x g에서 6분 동안 미세 원심분리기에서 혈액을 원심분리합니다. 혈액 경계면 위의 투명한 액체(혈청)를 두 번째 깨끗하고 라벨이 붙은 1.5mL 튜브에 수집합니다. 인간 및 마우스의 염증성 사이토카인 또는 면역글로불린 역가와 같은 다운스트림 분석을 위해 혈청을 -20°C에서 보관한다.
  3. 조직 해부
    1. 생쥐에서 종양 세포를 주사 및 성장시키고 약물 치료를 투여 한 후 조직을 수확합니다. 마우스를 폼 해부 보드에 놓고 핀을 제자리에 고정하고 팔과 다리를 45° 각도로 확장합니다. 복막 절단을 피하기 위해 골반 근처에서 시작하여 턱까지 뻗어 몸통 중앙을 절개하십시오 (필수는 아니지만). 피부를 가장자리로 당기고 핀으로 제자리에 고정합니다.
    2. 다음 순서로 미세 집게를 사용하여 림프절 (LN)을 추출하십시오 : 사타구니, 겨드랑이, 자궁 경부, 장간막, 열공.
      참고: HIS 마우스에서 LN은 종종 매우 작고, anlage와 유사하거나, 야생형 마우스와 달리 뚜렷한 모양으로 "염증"이 있습니다. 따라서 LN과 유사한 조직이 각 부위에서 채취됩니다. 주변 LN은 종종 유체로 채워진 "볼"로 나타나는 반면 장간막 LN은 더 조밀합니다. 장간막 LN은 가장 명확하고 일관성이 있으며 문자열과 달리 하나 또는 두 개의 뚜렷한 밀도가 높은 노드로 관찰됩니다.
    3. 페트리 접시에 담긴 8mL의 수확 배지에 있는 젖빛 유리 슬라이드의 한쪽 면에 LN을 놓습니다. 서리로 덥은 가장자리가 안쪽으로 향하도록 슬라이드를 수직 각도로 잡고 세포 내용물이 방출 될 때까지 조직을 부드럽게 누릅니다.
    4. 슬라이드를 떼어내고 함께 당겨 여러 번 헹구어 최대한의 세포를 방출합니다. 5인치 유리 피펫으로 세포를 수집하고 9인치 면 플러그 피펫을 통해 라벨이 붙은 15mL 원뿔형 튜브로 여과합니다.
    5. 두 쌍의 집게 또는 집게와 가위를 사용하여 복부의 왼쪽 상단에서 비장을 추출합니다. 재부유 매체의 부피 추정치로 비장의 크기를 기록하십시오. LN과 마찬가지로 젖빛 유리 슬라이드를 사용하여 기계적 소화로 비장을 수집하고 여과합니다.
      참고: 단세포 현탁액을 위한 조직 준비를 위한 모든 기술을 사용할 수 있습니다.
    6. 아래에 설명된 대로 조직 샘플에서 세포의 계수 및 재현탁을 수행합니다.
      1. 림프 세포를 4°C에서 10분 동안 360 x g 로 원심분리한다. 액체를 흡인하고 DNase를 사용하여 1mL의 수확 배지에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
      2. RT에서 3mL의 ACK 용해 완충액과 함께 3분 동안 배양한 후 10mL의 수확 배지/DNase를 첨가하여 비장 세포에서 적혈구를 제거합니다. 비장 세포를 다시 원심분리하고, 상층액을 흡인하고, 비장 크기(예: 매우 작은 비장의 경우 1mL, 가장 큰 비장의 경우 최대 10mL)에 따라 1-10mL의 수확 배지/DNase에 세포를 재현탁합니다.
      3. 10 μL의 세포 현탁액을 90 μL의 배지에 첨가하고 혈구계를 사용하여 계산합니다. LN과 비장 세포를 원심분리하고, 상층액을 흡인하고, 수확 배지에서 세포를 1 x 108 cells/mL 또는 최소 80μL의 농도로 재현탁합니다.
    7. 종양을 추출합니다.
      1. 집게로 종양을 잡고 해부 가위로 종양 가장자리를 천천히 잘라내어 열린 옆구리에서 종양을 제거합니다.
      2. 종양이 제거되면 무게를 측정하고 RNA 및 면역조직화학(IHC) 처리를 위해 1/4을 제거합니다. 1/4 종양을 반으로 나눕니다. 절반(전체 종양의 1/8)을 액체N2에 극저온 동결, 플래시 동결에 넣고 다운스트림 게놈 연구를 위해 -80°C에서 보관합니다.
      3. 종양의 나머지 1/8을 10% 포르말린이 포함된 라벨이 붙은 검체 튜브에 넣습니다. 다음날, 나중에 사용할 때까지 조직을 70 % 에탄올로 헹구고 다시 일시 중단하십시오. 종양의 나머지 3/4을 6cm 접시에 넣고 메스 블레이드를 사용하여 ~1mm 조각으로 다집니다.
      4. 종양 조각을 해리 튜브( 재료 표 참조)로 옮기고 불완전한 종양 침윤 백혈구(TIL) 배지 5mL로 접시를 헹구고 해리 튜브에 추가합니다.
        알림: 무게가 >0.4g인 종양의 경우 TIL 불완전 배지 10mL로 접시를 헹구고 해리 튜브에 추가합니다.
      5. 콜라게나제 제제( 재료 표 참조)를 해리 튜브의 조직에 최종 농도 50mg/mL로 추가합니다. 종양의 견고성에 따라 37°C에서 30분 내지 1시간 동안 기계적 해리를 사용하여 조직을 해리시킨다.
      6. 해리 후 현탁액을 100μm 필터를 통해 50mL 원뿔형 튜브에 통과시키고 10mL의 TIL 완전 배지로 필터를 헹굽니다. 이 배지의 혈청은 콜라게나제 반응을 멈추고 세포가 더 이상 분해되지 않도록 보호합니다.
      7. 단세포 현탁액을 4°C에서 10분 동안 360 x g 로 원심분리한다. 세포 현탁액이 P1000 피펫 팁을 쉽게 통과하고 다운스트림 분석을 위해 부피를 기록할 수 있도록 DNase를 사용하여 충분한 수확 배지에 펠릿을 재현탁합니다.
        참고: 부피가 작을수록 종양 면역 세포의 수집이 증가하지만 유세포 분석기 막힘에 더 취약합니다.

7. 세포 염색 및 유세포 분석

  1. 얼룩 준비 및 세포 도금
    1. 염색 칵테일 준비: 수확 당일에 염색 워크시트에 샘플 수를 추가합니다(표 2; "Conventional Flow A panel", "Spectral Flow B panel" 및 "Conventional Flow C panel" 워크시트)를 사용하여 모든 얼룩 및 인쇄물을 사용할 수 있습니다. 염색 완충액(SB)에서 염색 A 및 B에 대한 표면 염색 칵테일을 준비하고, 각 항체를 새 팁으로 개별적으로 첨가하고, 이동 중에 각 시약을 표시하고, 필요할 때까지 4°C에서 보관합니다. 아지드가 없는 PBS에서 적절한 생존력 염료를 준비하고 필요할 때까지 4°C에서 보관합니다(사용 전 RT로 따뜻하게). SB에서 2일째에 표면 염색 C 칵테일을 각각의 투과화 완충액에서 세포내 염색 B 및 C와 함께 준비합니다.
    2. 염색 워크시트의 모든 샘플에 대한 플레이트 레이아웃을 만들고 아지드가 없는 PBS 100μL를 웰에 분취합니다. 각 조직 및 염색(스펙트럼 세포 분석용)에 대해 염색되지 않은 대조군을 포함합니다.
    3. 50 μL의 PBS를 함유하는 96-웰 플레이트에 세포를 추가한다. 염색 A의 경우, 염색 워크시트에 명시된 대로 각 조직 그룹을 적절한 부피로 재현탁하고 같은 날 유세포 분석기에서 획득할 때까지 4°C에서 보관합니다. 염색 B와 C의 경우 PBS를 사용하여 25μL의 림프와 60μL의 비림프 조직 세포 현탁액을 웰에 추가합니다.
    4. 염색 C를 이용한 세포내 염색에 의한 검출을 위한 사이토카인의 시험관내 자극을 수행한다.
      1. 단계 7.1.3으로부터의 C 96-웰 플레이트를 4°C에서 3분 동안 680 x g 에서 원심분리하였다. 200 μL의 TIL 완전 배지 (RPMI 1640, 10 mM HEPES [pH 7], 10% FBS)를 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 세포 현탁액과 함께 4°C에서 밤새 보관한다.
      2. 다음날 아침 일찍, 세포 자극 칵테일( 재료 표 참조)을 완전한 TIL 배지에서 1:500으로 희석합니다. 세포 현탁액이 들어있는 플레이트를 680 x g 에서 원심분리하여 세포를 펠릿화하고 플릭하여 배지를 제거하였다. 제조된 세포 자극 칵테일 200μL에 세포를 재현탁하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
      3. 완전한 TIL 배지에 1:1,000 희석으로 모넨신을 함유한 단백질 수송 억제제 용액 25μL를 추가하고, 세포를 혼합하고, 사이토카인의 세포 내 축적을 허용하기 위해 추가로 37°C에서 4시간 동안 배양합니다.
    5. 세포 염색을 수행합니다.
      1. 염색 A 및 B(제1일) 및 염색 C(제2일)의 경우, 4°C에서 3분 동안 680 x g 로 원심분리한다. 플레이트를 튕기고 적절한 생존력 염료를 웰에 첨가하십시오. 멀티채널 피펫으로 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 잘 섞고 RT에서 15분 동안 배양합니다.
      2. 플레이트를 원심분리한 다음(단계 7.1.5.1에서와 같이) 플레이트에 적절한 표면 얼룩을 추가하고 다중 채널 피펫으로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 4°C에서 15분 동안 배양하고 다시 원심분리합니다. 플레이트를 튕기고 150μL의 SB로 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 세척하고 원심분리합니다.
      3. 플레이트를 튕기고 150μL의 SB로 부드럽게 피펫팅하여 세척을 반복하고 4°C에서 3분 동안 680 x g에서 원심분리합니다. 염색 A의 경우, 염색 워크시트에 명시된 대로 각 조직 그룹을 적절한 부피로 재현탁하고 4°C에서 보관합니다. 염색 B의 경우 RT에서 30분 동안 FoxP3 전사 인자 키트 고정액( 재료 표 참조)으로 고정합니다. 얼룩 C의 경우 RT에서 1분 동안 SB의 30%(v/v) 파라포름알데히드로 고정합니다.
      4. 고정판을 480 x g 에서 4°C에서 3분 동안 원심분리합니다. SB에서 1x 세척하십시오. 염색 B의 경우 세포를 밤새 방치할 수 있습니다.
      5. 세포 투과화: 염색 B에 대한 FoxP3 전사 인자 키트 투과화 완충액 150μL에 웰을 재현탁하고 Stain C에 대한 SB의 0.5%(w/v) 사포닌에 재현탁합니다. RT에서 15분 동안 인큐베이션합니다. 고정판을 480 x g 에서 4°C에서 3분 동안 원심분리합니다.
      6. 플레이트를 플릭하고 염색 B 및 염색 C에 대한 각각의 세포내 염색 칵테일을 추가합니다. RT에서 30분 동안 인큐베이션합니다.
      7. 고정판을 4°C에서 3분 동안 480 x g 로 원심분리하고 플레이트를 플릭합니다. 세포를 150 μL의 상응하는 투과화 완충액(염색 B, FoxP3 전사 인자 키트 투과화 완충액; 염색 C, 사포닌)으로 세척한다.
      8. 플레이트를 튕기고 150 μL의 SB에서 위아래로 피펫팅하여 세척합니다. 4 °C에서 3분 동안 480 x g 에서 원심분리합니다. 플레이트를 튕기고 염색 워크시트에 기록된 적절한 부피의 조직 그룹별로 SB의 세포를 재현탁합니다.
        참고: 이제 샘플은 스펙트럼 유세포 분석으로 수집할 준비가 되었습니다.
      9. 각 염색에 대한 적절한 단일 염색 대조군과 각 조직 그룹에 대한 염색되지 않은 샘플로 유세포 분석기( 재료 표 참조)를 설정하여 혼합 해제 중 자가형광의 차이를 설명합니다. 염색 워크시트(표 2)에 정의된 대로 조직 그룹별로 적절한 부피를 획득하고 .fcs 파일을 내보냅니다.
  2. 유세포 분석 데이터 분석
    1. 유세포 분석 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 새 작업 공간을 만듭니다. 각 장기(LN, 비장 및 TIL)에 대해 새 그룹을 만듭니다. 각 장기에 대한 .fcs 파일을 그룹으로 가져옵니다.
    2. 이변량 점도표를 만들고, 좌표축을 (FSC-A x SSC-A)로 설정하고, 셀룰러 이벤트에 다각형 게이트를 적용하여 가장자리의 이벤트(모든 셀 게이트)를 방지합니다. 셀룰러 이벤트를 선택하고, 축을 (FSC-A x FSC-H)로 변경하고, 선형 대각선의 이벤트에 다각형 게이트를 적용하고, 대각선에서 벗어나 "싱글릿" 게이트를 생성하는 이벤트를 제외합니다. "singlets" 게이트를 선택하고 축을 (hCD45 x mCD45)로 변경합니다. hCD45 및 mCD45 양성 이벤트에 폴리곤 게이트를 적용하고 각각 "인간" 및 "마우스"로 이름을 지정합니다.
    3. 인간 인구를 선택하고 Y축을 Live/Dead Aqua로 변경합니다. Live/Dead 음성, hCD45 양성 모집단에 다각형 게이트를 적용하고 이름을 "살아있는 인간"으로 지정합니다. 마우스 채우기를 선택하고 X축을 Live/Dead Aqua로 변경합니다. Live/Dead 네거티브, mCD45 포지티브 모집단에 폴리곤 게이트를 적용하고 이름을 "live mouse"로 지정합니다.
    4. 유사한 방식으로, "Conventional Flow A Gating", "Spectral Flow B Gating" 및 "Conventional Flow C Gating" 워크시트(표 2)에 요약된 바와 같이 부모 게이트와 X축 및 Y축을 선택하여 표시된 집단(예: 인간 B 세포, 활성화된 T 세포)을 분리합니다.
      참고: 각 얼룩(블리드, A, B, C)에 대한 대표적인 게이팅은 보충 파일 2에 포함되어 있습니다.
    5. 유세포 분석 소프트웨어에서 모든 모집단에 대한 개수 및 주파수 내보내기 테이블을 생성하고 스프레드시트 소프트웨어로 내보낼 수 있습니다. 빈도에 대한 부모 모집단은 표 2에 표시되어 있습니다.
    6. 데이터를 사용하여 실험 처리 그룹을 기반으로 그래프를 생성합니다.
      참고: 데이터는 분석 소프트웨어에서 R 패키지를 사용하여 분석할 수도 있습니다. 연결할 모든 샘플에서 단일 .fcs 파일을 만들 수 있습니다. 이 데이터는 T-SNE 알고리즘을 사용하여 조직 유형 및 치료 그룹에 대한 키워드 매개변수를 추가하면서 차원적으로 축소할 수 있습니다. 그런 다음 FlowSOM 알고리즘을 사용하여 모집단을 클러스터링하고 ClusterExplorer 도구를 사용하여 모집단을 식별할 수 있습니다. 새로운 세포 집단은 이러한 방식으로 식별되고, 시각적으로 비교되며, 치료 그룹 간 또는 다양한 조직 내에서 정량화될 수 있습니다.
    7. 종양 성장 억제와 상관관계가 있는 면역형을 정의하기 위해 동일한 치료 그룹 내의 종양에 대한 면역 매개변수를 해당 종양의 성장과 연관시킵니다. 해당 종양에 대한 특이적 성장률(SGR)로 종양 성장을 정량화하며, 이는 지정된 시간 동안 종양 부피의 차이를 고려한 측정입니다. 이 측정은 마우스 건강 및 치료 시작 날짜로 인해 다른 날에 적출된 종양을 정상화합니다.
      figure-protocol-21598

결과

측면 종양 프로토콜 및 실험 타임라인(그림 1)에 따라 표적 티로신 키나제 억제제(TKI) 요법과 니볼루맙 병용 치료에 대한 종양 성장 및 면역 반응이 두 가지 별개의 인간 결장직장암(CRC) PDX에서 연구되었습니다. TKI 약물은 종양 성장을 평가하기 위해 면역 결핍 숙주에서 연구되었습니다29. 이 모델은 TKI 단독, 그리고 더 중요하게는 항-PD-1과 조합하여 면역 반?...

토론

지난 6 년 동안 면역학 및 인간화 마우스에 대한 전문 지식을 사용하여 우리 연구팀은 다양한 인간 종양 3,7,30,31에 대한 면역 요법을 테스트하기 위해 필요한 전임상 모델을 개발했습니다. 이 프로토콜은 면역 요법 중심의 인간 T 세포 집단에 특별한 주의를 기울여 모델의 가변성에 대한 고려를 강조합...

공개

없음.

감사의 말

우리 생쥐를 돌봐준 동물 연구 시설(OLAR)과 우리 연구소의 암 센터 지원 보조금(P30CA046934)이 지원하는 유세포 분석 공유 자원에 감사드립니다. 우리는 또한 HIS-BRGS 모델에서 인간 PDX에 대한 면역 요법을 연구하는 첫 번째 협력에 대해 Gail Eckhardt와 Anna Capasso에게 감사를 표합니다. 이 연구는 PHISM(전임상 인간 면역 체계 마우스 모델) 공유 리소스, RRID: SCR_021990 및 유세포 분석 공유 리소스, RRID: SCR_022035를 사용하여 국립 보건원 P30CA06934 암 센터 지원 보조금에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 이 연구는 계약 번호 75N93020C00058에 따라 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 NIAID에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringe w/needlesMcKesson1031815
15 mL tubesGrenier Bio-One188271
2-mercaptoethanolSigmaM6250
50 mL tubesGrenier Bio-One227261
AutoMACS Pro SeparatorMiltenyi130-092-545
BD Golgi Stop Protein Transport Inhibitor with monensinBD BioscienceBDB563792
BSAFisher ScientificBP1600100
Cell Stim CocktailLife Technologies509305
Chill 15 RackMiltenyi130-092-952
Cotton-plugged glass pipettesFisher Scientific13-678-8B
Cultrex Basement membrane extractR&D Systems363200502
Cytek AuroraCytek
DNaseSigma9003-98-9
eBioscience FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer SetInvitrogen00-5523-00
Embryonic Stemcell FCSGibco10439001
Eppendorf Tubes; 1.5 mL volumeGrenier Bio-One616201
ExcelMicrosoft
FBSBenchmark100-106 500mL
Ficoll HypaqueGE Healthcare45001752
FlowJo SoftwareBD Biosciences
Forceps - fineRoboz Surgical RS5045
Forceps normalDumontRS4919
FormaldehydeFisherF75P1GAL
Frosted Glass SlidesCorning1255310
Gentlemacs C-TubesMiltenyi   130-096-334
GentleMACS DissociatorMiltenyi130-093-235
glass pipettesDWK Life Sciences63A53
GlutamaxGibco11140050
HBSS w/ Ca & MgSigma55037C
HEPESCorningMT25060CI
IgG standardSigmaI2511
IgM standardSigma401108
IMDMGibco12440053
Liberase DLRoche5466202001
LIVE/DEAD Fixable BlueThermoL23105
MDA-MB-231ATCCHTB-26
MEMGibco1140050
mouse anti-human IgG-APSouthern BiotechJDC-10
mouse anti-human IgG-unabeledSouthern BiotechH2
mouse anti-human IgM-APSouthern BiotechUHB
mouse anti-human IgM-unlabeledSouthern BiotechSA-DA4
MultiRad 350Precision X-Ray
PBSCorning45000-446
Pen StrepGibco15140122
Petri DishesFisher ScientificFB0875713A
p-nitrophenyl substrateThermo34045
PRISMGraphpad
Rec Hu FLT3LR&D systems308-FK-005/CF
Rec Hu IL6R&D systems206-IL-010/CF
Rec Hu SCFR&D systems255SC010
RPMI 1640Corning45000-39
SaponinSigma8047-15-2
ScissorsMcKesson862945
Serological pipettes 25 mLFisher Scientific1367811
Sterile filterNalgene567-0020
Sterile molecular waterSigma7732-18-5
Yeti Cell AnalyzerBio-Rad12004279
Zombie Greenbiolegend423112

참고문헌

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