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요약

여기에서는 상보적 금속 산화물 반도체 고밀도 미세전극 어레이 시스템(CMOS-HD-MEAs)을 사용하여 생체 외 뇌 절편에서 발작과 같은 활동을 기록하는 프로토콜을 간략하게 설명합니다.

초록

상보적 금속-산화물-반도체 고밀도 미세전극 어레이(CMOS-HD-MEA) 시스템은 세포 배양 및 생체 외 뇌 절편의 신경 생리학적 활동을 전례 없는 전기생리학적 세부 사항으로 기록할 수 있습니다. CMOS-HD-MEA는 세포 배양에서 고품질 신경 단위 활동을 기록하도록 먼저 최적화되었지만, 급성 망막 및 소뇌 절편에서 고품질 데이터를 생성하는 것으로도 나타났습니다. 연구원들은 최근 CMOS-HD-MEA를 사용하여 급성 대뇌 피질 설치류 뇌 절편에서 국소 자기장 전위(LFP)를 기록했습니다. 관심 있는 LFP 중 하나는 발작과 유사한 활동입니다. 많은 사용자가 CMOS-HD-MEA를 사용하여 짧고 자발적인 간질형 방전을 일으켰지만, 고품질의 발작과 같은 활동을 안정적으로 생성하는 사용자는 거의 없습니다. 전기 노이즈, 수중 기록 챔버를 사용할 때 발작과 같은 활동을 생성하는 일관되지 않은 특성, 2D CMOS-MEA 칩이 뇌 절편 표면에서만 기록한다는 제한 등 많은 요인이 이러한 어려움에 기여할 수 있습니다. 이 프로토콜에 자세히 설명된 기술을 통해 사용자는 CMOS-HD-MEA 시스템을 사용하여 급성 뇌 절편에서 고품질 발작과 같은 활동을 지속적으로 유도하고 기록할 수 있습니다. 또한 이 프로토콜은 CMOS-HD-MEA 칩의 적절한 처리, 실험 중 용액 및 브레인 슬라이스 관리, 장비 유지 관리에 대해 설명합니다.

서문

수천 개의 기록 포인트(1,2)가 있는 MEA 칩과 데이터를 증폭하고 디지털화하기 위한 MEA 플랫폼을 포함하는 상업적으로 이용 가능한 고밀도 미세전극 어레이(HD-MEA) 시스템은 전기생리학 연구를 위한 새로운 도구입니다. 이러한 HD-MEA 시스템은 CMOS(Complementary Metal-Oxide-Semiconductor) 기술을 사용하여 세포 배양 및 생체 외 뇌 절편 제제의 고감도로 전기생리학적 데이터를 기록합니다. 이러한 MEA 시스템은 높은 전극 밀도와 고품질 신호 대 잡음비를 통해 신경 생리학 연구에 전례 없는 공간적, 시간적 해상도를 제공합니다3. 이 기술은 주로 세포외 활동 전위를 연구하는 데 사용되어 왔지만, 다양한 신경 세포 뇌 절편 제제(4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15)에서 고품질 국소 자기장 전위(LFP)를 캡처할 수도 있습니다

프로토콜

생쥐와 관련된 시술은 브리검 영 대학교의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았다. 수컷 및 암컷(n=8) C57BL/6 마우스를 P21 이상으로 숙성시킨 다음 실험에 사용하였다.

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그림 1: CMOS-HD-MEA 실험의 개략도. (A) 뇌 절편은 선호하는 절단 방법으로 준비하고 MEA에 맞게 하위 절개합니다. (B) 용액과 CMOS-HD-MEA 칩을 준비합니다. (C) 하위 절개된 뇌 절편을 전극 어레이에 놓고 적절한 용액에 담근다. (D) 수집된 데이터에서 관련 채널을 선택합니다. 그런 다음 사용자가 선호하는 프로그램에서....

대표적 결과

여러 채널 1,4,5,10의 활동을 시각화할 때 표준적으로 사용되는 것처럼, 먼저 CMOS-HD-MEA로 획득한 데이터의 래스터 플롯을 생성하는 것이 좋습니다(그림 4A,C,E). 이 플롯은 각 채널을 y축에 표시하고 시간을 x축에 표시하여 각 브레?.......

토론

이 프로토콜에는 CMOS-HD-MEA 사용자가 직면하는 일반적인 문제, 즉 뇌 절편 아래의 소음 발생 및 뇌 절편을 위한 건강한 환경 유지를 해결하는 급성 뇌 절편 관리와 관련된 특정 지침이 포함되어 있습니다. 슬라이스 아래의 소음 발생은 슬라이스가 어레이에 제대로 부착되지 않을 때 발생합니다. 브레인 슬라이스가 적절하게 부착되지 않으면 슬라이스 아래에 공기 주머니가.......

공개

저자들은 이 연구 연구와 관련된 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 말

저자들은 이 원고를 편집해 준 전현직 Parrish 연구실 직원들에게 감사를 표한다. 또한 이 작업에 대한 피드백을 제공해 주신 3Brain의 Alessandro Maccione에게도 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 AES/EF Junior Investigator Award와 Brigham Young University Colleges of Life Sciences and of Physical and Mathematical Sciences의 후원을 받았습니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
2D WorkbenchCloudrayLM04CLLD26B
4-AminopyridineSigma-Aldrich275875
Accura Chip3BrainAccura HD-MEACMOS-HD-MEA chip
AgaroseThermo Fisher ScientificBP160-100
Vibration isolation tableKinetic Systems91010124
Beaker for the slice holding chamber, 270 mLVWR10754-772
BioCam3BrainBioCAM DupleXCMOS-HD-MEA platform
Brainwave Software3BrainVersion 4CMOS-HD-MEA software
Calcium ChlorideThermo Fisher ScientificBP510-500
CarbogenAirgasX02OX95C2003102
CarbogenAirgas12005
Carbogen StonesSupelco59277
CompresstomePrecissionaryVF-300-0Z
ComputerDellPrecission3650
Crocodile Clip Grounding CablesJWQIDIB06WGZG17W
DetergentMetrex10-4100-0000
D-GlucoseMacron Fine Chemicals4912-12
Dihydrogen Sodium PhosphateThermo Fisher ScientificBP329-500
DinoCamDino-LiteAM73915MZTL
EthanolThermo Fisher ScientificA407P-4
ForcepsFine Science Tools11980-13
Hot plateThermo Fisher ScientificSP88857200
Ice MachineHoshizakiF801MWH
Inflow and outflow needlesJensen GlobalJG 18-3.0X
Inline Solution HeaterWarner InstrumentsSH-27B
IsofluorineDechra08PB-STE22002-0122
Kim WipesThermo Fisher Scientific06-666
Magnesium ChlorideThermo Fisher ScientificFLM33500
MicropipetsGilsonF144069
Mili-Q Water FilterMili-QZR0Q008WW
PaintbrushDaler RowneyAF85 Round: 0
Paper FilterWhatmanEW-06648-24
ParafilmAmerican National CanPM996
Perfusion SystemMulti Channel SystemPPS2
PipetorThermo Fisher ScientificFB14955202
Platinum Harp3Brain3Brain
Potassium ChlorideThermo Fisher ScientificP330-3
Razor bladePersonnaBP9020
ScaleMetter ToledoAB204
ScissorsSolingen92008
Slice Holding ChamberCustomCustomCustom 3D Printer Design, available upon request
Sodium BicarbonateMacron Fine Chemicals7412-06
Sodium ChlorideThermo Fisher ScientificS271-3
Temperature Control BoxWarner InstrumentsTC344B
Transfer PipettesGenesee Scientific30-200
TubingTygonB-44-3 TPE
Vibratome VZ-300PrecissionaryVF-00-VM-NC
Weigh BoatElectron Microscopy Sciences70040

참고문헌

  1. Obien, M. E. J., Frey, U. Large-scale, high-resolution microelectrode arrays for interrogation of neurons and networks. Adv Neurobiol. 22, 83-123 (2019).
  2. Schroter, M., et al. Functi....

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