먼저, 광택 커버 슬립의 시드 HEK293A 세포는 80% 합류할 때까지 고포도당 DMEM이 포함된 24웰 플레이트에 배치됩니다. 다음 날, Earl의 균형 잡힌 소금 용액에서 2시간 동안 세포를 굶겼습니다. 처리 후 배지를 흡인하고 PBS에 500마이크로리터 또는 4% 포름알데히드 용액을 첨가하고 실온에서 20분 동안 배양하여 세포를 고정합니다.
고정 후 포름알데히드 용액을 500마이크로리터의 PBS로 교체합니다. 다음으로, PBS에 500 마이크로 리터의 염화 암모늄 용액 500 마이크로 리터를 실온에서 10 분 동안 첨가하여 유리 알데히드 기를 담금질합니다. 염화암모늄 용액을 PBS에서 500마이크로리터의 밀리리터당 50마이크로그램 디지토닌 용액으로 교체하여 세포를 투과시킵니다.
투과화 후 디지토닌 용액을 PBS 세척을 세 번 반복하는 500마이크로리터의 PBS로 교체합니다. 마지막 세척 후 실온에서 30분 동안 500마이크로리터의 차단 용액에 세포를 배양합니다. 배양 후 차단 용액을 500 마이크로 리터의 PBS로 교체하십시오.
다음으로 핀셋을 사용하여 우물에서 덮개 슬립을 수집하고 얇은 티슈 물티슈를 사용하여 여분의 PBS를 제거합니다. 가습 챔버에서 세포 면이 아래로 향하게 하여 커버 슬립을 50마이크로리터 1차 항체 용액 위에 부드럽게 떨어뜨립니다. 실온에서 1시간 동안 가습된 챔버에서 세포를 배양합니다.
배양 후 커버 슬립을 모아 여분의 1차 항체 용액을 배출합니다. 셀 면이 위로 향하게 하여 커버 슬립을 24웰 플레이트에 다시 놓고 PBS로 세 번 세척합니다. 마지막 세척 후 커버 슬립을 수집하고 여분의 PBS를 배출한 후 세포 면이 아래로 향하도록 각 커버 슬립을 50마이크로리터 2차 항체 용액 방울에 놓습니다.
가습 챔버에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 과잉 2차 항체 용액을 배출하고 24웰 플레이트에서 500마이크로리터의 PBS로 커버 슬립을 세 번 세척합니다. 과잉 PBS를 배수한 후에, 걸이 해결책의 50 마이크로리터 하락에 세포 측을 가진 각 덮개 미끄러짐을 4개에 묽게 한 것, PBS에 있는 000 가습한 약실에 두십시오.
가습 챔버에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, 여분의 후크 용액을 제거하고 커버 슬립을 PBS로 세 번, 24웰 플레이트에서 탈이온수로 한 번 세척합니다. 과도한 탈이온수를 배출한 후 각 커버 슬립을 기포 형성을 피하면서 현미경 슬라이드에 10-20마이크로리터 방울의 장착 용액을 놓습니다.
