ATG9A 구조체의 라이브 셀 이미징을 위해 2mL의 고포도당 DMEM에 있는 HEK293A 세포를 65-70% 밀도에 도달할 때까지 60mm 조직 배양 접시에 파종합니다. 다음날 리포펙타민 DNA 혼합물을 준비하여 4밀리리터의 성장 배지가 들어 있는 세포 배양 플레이트에 추가하고 플레이트를 앞뒤로 부드럽게 흔들어 혼합물이 고르게 분포되도록 합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 10%에서 세포를 배양합니다.
형질주입 4시간 후 성장 배지를 새로운 배지로 교체하고 10%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 밤새 세포를 배양합니다. 다음날 트립신 EDTA를 첨가하여 세포를 트립신화합니다. 그런 다음 분리된 세포의 수를 세고 살아있는 현미경 검사에 적합한 배양 접시에 밤새 다시 파종합니다.
다음 날, 컨포칼 현미경을 사용하여 세포를 이미지화합니다. 기저 조건에서 ATG9A는 내인성 단백질의 면역형광에 의해 표시되는 대로 주로 골지체 네트워크에 국한되며 시스-골지 마커인 GM130과 겹칩니다. eGFP N-말단 표지 ATG9A 및 mRFP N-말단 표지 ATG9A는 골지체에서 덜 국소화되어 주로 소포에 존재했습니다.
대조적으로, eGFPc 말단 태그가 부착된 ATG9A는 세포 내에서 응집되기 쉽습니다. N-말단 형광단과 ATG9A 사이에 3x-FLAG 염기서열을 융합하면 과발현된 단백질이 내인성 단백질과 유사하게 작용할 수 있습니다. 과발현된 mCherry 3x-FLAG ATG9A는 공급 조건에서 Golgi 마커 GM130과 공동 국소화됩니다.
이 국소화와 AG9A 소포 구획은 시간이 지남에 따라 보존되어 ATG9A의 밀매에 대한 시공간 연구가 가능했습니다.
