이 방법은 MSR-1, AMB-1 및 MS-1이라고 불리는 3종의 자기성 박테리아를 재배할 수 있습니다. 모든 담수 종, 그리고 속 자성구리움에서 모두. 그것은 이 유기체를 관련시키는 재현가능한 연구의 어떤 종류에 대한 필수적인 첫번째 단계입니다.
자기 전술 박테리아는 매우 구체적인 산소 요구 사항이, 그래서 그들은 자기 탐색 시스템을 개발. 따라서 그들에게 사용할 수있는 산소의 양을 제어하는 것이 매우 중요합니다. 이 프로토콜의 모든 민물 자기 피릴라의 몇 가지 특정 변종에 최적화 되었습니다.
그 세부 사항은 다른 자기 전술 박테리아의 산소와 영양소 요구 사항을 수용하기 위해 최적화 할 수 있습니다. 질소 스테이션을 설치하기에 충분한 공간이 있는 벤치 근처에 질소 가스 탱크를 안전하게 설치합니다. 역이 건설 될 지역에 도달 할 만큼 긴 탱크에 튜브의 조각을 연결합니다.
필요한 경우 누출을 방지하기 위해 탱크출력에 테플론 테이프를 적용하십시오. 5병의 매체를 동시에 버블링할 수 있는 스테이션을 건설하기 위해, 5센티미터 길이의 4개의 튜브를 잘라냅니다. 3방향 T자 형 플라스틱 피팅 3개로 튜빙 조각을 조합합니다.
이 라인의 한쪽 끝을 질소 탱크의 출력에 튜브 조각에 추가 T 자형 피팅을 연결합니다. 다른 쪽 끝에 90도 팔꿈치 피팅을 추가합니다. 테이프를 사용하여 구조물을 벤치 위에 30센티미터 떨어진 수평 금속 막대에 부착합니다.
설치 된 피팅의 세 출력에 길이 20 센티미터의 튜브 의 다섯 조각을 연결합니다. 5개의 1밀리리터 플라스틱 주사기에서 피스톤을 제거하고, 이 주사기의 더 큰 끝을 잘라내어 졸업한 부분만 유지합니다. 이 주사기를 면으로 채우고 너무 단단히 포장하지 않도록주의하십시오.
20센티미터 길이의 수직 튜브 에 주사기를 삽입합니다. 가스를 켜고 비눗물을 사용하여 질소가 흐르면 누출이 없도록 합니다. 5 개의 25 게이지 바늘의 캡을 제거하고 이 바늘을 얇은 튜브의 10센티미터 조각에 삽입하십시오.
준비된 바늘을 질소 스테이션의 주사기에 부착합니다. 질소가 5개 선 모두를 통해 흐르는지 확인하고 스테이션을 대기 상태로 유지합니다. 10밀리알페라 페릭 구연산용액을 100밀리리터에 0.245그램의 페리 구연산제에 첨가하여 준비합니다.
가열하고 오렌지 클리어 용액이 얻어지을 때까지 녹입니다. 용액을 121도에서 15분 이상 노출한 후 어두운 실온에서 멸균 된 스톡 솔루션을 저장합니다. MSR-1용 액체 성장 배지 5병을 준비하려면 증류수 300밀리리터를 포함하는 비커에 텍스트 프로토콜에 나열된 화학 물질을 추가합니다.
멸균 페라닉 구연산및 미네랄 용액의 첨가는 멸균 기술을 사용하여 분젠 버너의 불꽃 아래에서 수행해야 합니다. 멸균 조건은 다른 세균성 종에 의한 배양의 오염을 피하기 위해 필수적입니다. 모든 화학 물질을 첨가한 후, 1개의 어금니 나트륨 수산화용액으로 pH를 7.0으로 조정한다.
갓 준비된 배지를 125밀리리터 세럼 병에 담아 각 병에 60밀리리터의 배지를 붓습니다. 질소 스테이션에 연결된 작은 튜브를 사용하여 용존 산소를 제거하기 위해 30 분 동안 배지로 질소를 거품. 각 병 위에 부틸 고무 스토퍼를 놓고 여분의 가스가 병을 빠져나갈 수 있도록 작은 개구부를 남깁니다.
30분 후, 준비된 스토퍼와 알루미늄 씰로 각 병을 밀봉합니다. 알루미늄 씰은 나머지 프로토콜 중에 병이 밀봉되도록 합니다. 질소 스테이션에서 바늘과 얇은 튜브를 분리하고 깨끗한 바늘로 대체하십시오.
질소 탱크의 밸브를 조정하여 부드럽고 연속적인 가스 흐름이 탱크를 빠져나옵니다. 이제 질소 탱크에 연결된 바늘 중 하나를 고무 스토퍼를 통해 배지 병에 삽입합니다. 즉시 같은 병에 다른 깨끗한 바늘을 삽입합니다.
다른 병에 대해 이 단계를 반복하고 질소가 약 30분 동안 흐르면 병의 공기를 질소로 대체하십시오. 30분 후, 해당 바늘을 제거하여 질소 스테이션에서 1병을 분리합니다. 매체 병의 압력이 대기압으로 감소할 때까지 몇 초 동안 기다렸다가 두 번째 바늘을 제거하십시오.
남은 모든 병에 대해 이 단계를 반복합니다. MSR-1용 반고체 성장 배지 120밀리리터를 제조하려면 비커를 알루미늄 호일로 덮고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 제조된 솔루션을 자동 복제합니다. 오토클레이브 주기가 끝나기 직전에, 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이, 새로운 4%시스테인 용액을 준비하고 5개의 어금니 나트륨 수산화용액으로 pH를 7.0으로 조정한다.
오토클레이브 후, 매체를 섭씨 50~60도로 식히고, 분젠 버너의 불꽃 아래에서 비커를 가져온다. 알루미늄 호일을 제거하고 부드럽게 교반하면서 멸균 기술을 사용하여 텍스트 프로토콜에 나열된 화학 물질을 신속하게 추가합니다. 필터 살균 시스테인 용액 1.2 밀리리터를 추가합니다.
모든 화학 물질을 첨가한 후 따뜻한 배지를 16 밀리리터 멸균 나사 캡 Hungate 튜브로 옮기십시오. 배지의 12 밀리리터를 각 튜브로 옮기고 튜브를 밀봉합니다. 액체 매체에서 MSR-1, AMB-1 및 MS-1균제의 침구를 접종하기 위해 스토퍼에 에탄올을 적용하고 분젠 버너의 불꽃을 통과하여 산소와 신선한 중간 크기의 상단을 화염.
멸균 주사기와 바늘을 사용하여 산소 병에서 1 밀리리터의 산소를 추출하여 신선한 중간 크기 병으로 옮습니다. 유리병에서 자란 다른 배양으로부터의 접종을 사용하는 경우, 두 병을 모두 화염. 그런 다음 오래된 문화의 1 밀리리터를 신선한 매체로 접종합니다.
문화를 섭씨 32도에서 배양하고 4~7일 후에 신선한 매체로 접종합니다. 산소 그라데이션, 반고체 배지에서 MSR-1을 접종하기 위해, 신선한 배지의 튜브가 잘 정의된 OAI를 표시하고, 분홍색으로 유색 인터페이스에 의해 중간 표면 아래 약 1~3cm를 나타낸다는 것을 확인한다. 접종이 다른 산소 농도 그라데이션 반고체 배양에서 오는 경우, 박테리아에 의해 형성된 밴드에 배치된 멸균 파이펫 팁으로 배양의 50 마이크로리터를 심서 박테리아를 수확한다.
인터페이스를 방해하는 것을 피하면서 OAI에서 이러한 박테리아를 신선한 배지에서 천천히 접종합니다. 튜브를 밀봉하고 박테리아가 섭씨 25도에서 섭씨 30도 사이로 자랄 수 있습니다. 박테리아가 자기와 모달인지 확인하기 위해 현미경 커버 슬립에 배양 한 방울을 놓습니다.
커버 슬립을 뒤집어 유리 슬라이드에 놓는 O 링에 설치합니다. 드롭이 하단 슬라이드에 닿지 않는지 확인합니다. 매달려 있는 방울을 현미경 아래에 놓고 물방울 가장자리에 집중하십시오.
자석의 남극을 그 가장자리에 가깝게 놓고 박테리아가 가장자리를 향해 수영하는 것을 지켜보십시오. 자석을 뒤집어 반대 방향으로 수영할 수 있도록 합니다. 여기에 접종 전과 세균 성장 후 액체 매체의 병이 표시됩니다.
두 번째 병의 탁도는 박테리아가 성장하고 있음을 나타냅니다. 이 두 번 가속 영화는 모달 과 자기 자기 자기 박테리아 문화에 대한 매달려 드롭 실험의 예상 결과를 보여줍니다. 박테리아는 자기장이 적용될 때 처음에 물방울의 가장자리를 향해 헤엄쳤다.
자석의 필드 방향이 반전되면 박테리아가 자기장이 적용되는 가장자리에서 멀리 헤엄치게 됩니다. 여기에 접종 전과 세균 성장 후 반고체 배지의 튜브가 표시됩니다. 예상대로, 박테리아의 밴드는 산화 무산소 인터페이스에서 형성하고 산소가 소비되고 인터페이스가 위로 이동함에 따라 시간이 지남에 따라 마이그레이션됩니다.
여기에 표시된 자기 첨탑의 대표적인 전자 현미경 그래프입니다. 표기는 검은 화살표로 표시되고 빨간색 화살표는 자력을 표시합니다. 이 절차를 시도할 때, 자기 성 박테리아는 모두 제대로 성장하고 자기를 생산하기 위해 매우 구체적인 산소 수준 요구 사항이 있음을 기억하는 것이 매우 중요합니다.
이 프로토콜은 이러한 유기체가 선호하는 미생물 조건을 달성하기 위해 성장 매체의 산소 수준을 제어하고 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 이 방법에 따라, 건강하고 높은 자기 세포의 고농도를 얻을 수있다. 이러한 방식으로, 다량의 박테리아를 필요로 하는 실험은 자기추출, 유전체학 및 유전연구, 또는 현미경검사법에 의한 집단운동 관찰과 같은 수행될 수 있다.
실험실에서 자기 조직 박테리아를 성장 하는 가능성은 정말 이러한 유기 체의 매혹적인 생화 확 적인 및 물리적 속성 체계적인 방법으로 탐험 하는 과학자 를 허용 했다.
