초저온 전자 현미경에 의한 미세소관 상호 작용 단백질의 구조 연구는 세포 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다. Cryo-EM 그리드에서 상호 작용하는 단백질에 결합된 균일한 미세소관을 준비하는 것은 성공에 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 간단하고 저렴하며 초저온 전자 현미경을 위한 충분한 양과 질로 제어된 번역 후 변형으로 미세소관을 준비할 수 있습니다.
미세소관은 온도에 매우 민감합니다. 따라서 해중합을 방지하기 위해 미세소관 함유 용액을 따뜻하게 유지하는 것이 중요합니다. 시작하기 위해, 6 내지 12개의 융합 플레이트가 얻어질 때까지 DMEM 세포 배양 배지에서 유전자 변형 HCT116 세포주를 배양한다.
세포를 10 밀리리터의 PBS로 부드럽게 세척하여 임의의 세포 배양 배지를 제거한다. 5밀리몰 EDTA가 보충된 3밀리리터의 얼음-차가운 PBS로 실온에서 5분 동안 세포를 인큐베이션한 후, 세포 스크레이퍼를 사용하여 플레이트로부터 세포를 분리한다. 얼음 위의 50 밀리리터 튜브에 세포를 모으고 250G에서 10 분 동안 회전시킵니다.
튜브의 체적 스케일로 수확 된 세포의 부피를 확인하십시오. 수확된 세포 펠릿을 동일한 부피의 용해 완충액에 재현탁하고 초음파 처리에 의해 세포를 용해시킵니다. 초음파 처리 후, SDS-PAGE 분석을 위해, 18 마이크로 리터의 물과 5 마이크로 리터의 5X SDS 샘플 버퍼가 들어있는 튜브에 2 마이크로 리터의 용해물을 첨가하십시오.
나머지 용해된 세포를 원심분리기 튜브에 피펫팅하고 초원심분리기 로터에서 섭씨 4도에서 1시간 동안 100, 000G에서 회전시켜 용해물을 제거합니다. 주사기를 사용하여 펠릿과 상단의 부유층을 방해하지 않고 제거된 용해물을 제거합니다. 18마이크로리터의 물과 5마이크로리터의 5X SDS 샘플 버퍼가 들어 있는 튜브에 2마이크로리터의 투명화된 용해물을 추가합니다.
펠릿을 조심스럽게 헹구고 펠릿을 통해 P-10 피펫 팁을 소용돌이 치면서 펠릿을 약간 퍼냅니다. 그런 다음 200 마이크로 리터의 물과 50 마이크로 리터의 SDS 버퍼를 추가합니다. 수집 된 상청액에 1 밀리몰 GTP와 20 마이크로 몰 파클리탁셀을 첨가하여 미세 소관을 중합하고 섭씨 37도에서 30 분 동안 배양하여 미세 소관이 조립되도록합니다.
400 마이크로리터의 용해 완충액에 600 마이크로리터의 글리세롤을 첨가하여 쿠션 완충액을 제조하고, 혼합물에 20 마이크로몰 파클리탁셀을 보충한다. 버퍼를 섭씨 37도로 예열합니다. 800마이크로리터의 쿠션 버퍼를 초원심분리기 튜브에 추가합니다.
그런 다음 GTP-파클리탁셀이 보충된 용해물을 쿠션 버퍼 위에 조심스럽게 피펫팅합니다. 튜브를 초 원심 분리기 로터에 넣어 섭씨 30도에서 30 분 동안 100, 000G에서 회전시킵니다. 미세소관 펠릿이 형성되어야 하는 위치를 쉽게 인식할 수 있도록 튜브의 바깥쪽을 향한 가장자리를 표시하십시오.
원심분리 후, 펠릿을 방해하지 않고 피펫을 사용하여 쿠션 버퍼를 조심스럽게 제거합니다. 펠릿 옆에 용해 완충액을 조심스럽게 추가하고 튜브를 몇 번 회전시켜 펠릿과 튜브 벽에서 가능한 한 많은 글리세롤을 제거한 다음 흡인하고 세척 단계를 세 번 반복합니다. 세척된 펠릿을 50마이크로리터의 예열된 재현탁 완충액에 절단된 팁으로 부드럽게 재현탁하고 튜브를 섭씨 37도에 놓습니다.
18 마이크로리터의 물과 5 마이크로리터의 5X SDS 샘플 버퍼에 2 마이크로리터의 재현탁 펠릿 분획을 추가합니다. 압지를 설치하여 플런지 냉동 장치를 준비합니다. 장치 온도를 섭씨 30도로 설정하고 가습을 100%장치가 30분 동안 평형을 유지하도록 합니다.
두 가지 적용을 위해 플런지 냉동고의 설정을 준비합니다. 첫 번째 응용 프로그램의 경우 force를 10, 2초 블롯 시간, 0초 대기 시간으로 설정합니다. 두 번째 적용의 경우 힘을 10, 6.5초 블롯 시간 및 10초 대기 시간으로 설정합니다.
탄소 면이 위로 향하도록 그리드를 금속 글로우 배출기 차량에 놓습니다. 극저온 전자 현미경 또는 EM 그리드를 30밀리암페어에서 60초 동안 글로우 방전합니다. 액체 질소로 폴리스티렌 용기 어셈블리를 냉각하고 차가운 금속 컵에 에탄 가스를 응축하여 금속 컵에 액체 에탄을 준비합니다.
미세소관 상호작용 단백질을 희석 완충액으로 같은 부피로 희석한 후 그리드에 적용하여 세포 농도를 낮춥니다. 믹서를 섭씨 37도에 놓습니다. 플런지 동결 장치 근처에 가열 블록이 없는 경우 절연 폴리스티렌 상자에 따뜻한 금속 블록을 사용하십시오.
플런지 핀셋으로 글로우 방전 그리드를 잡고 플런지 냉동고에 딸깍 소리를 냅니다. 액체 에탄이 담긴 폴리스티렌 용기를 플런지 냉동고에 넣고 준비된 프로그램을 실행합니다. 먼저, 3.5 마이크로 리터의 미세 소관 용액을 그리드에 적용하십시오.
플런지 냉동고가 그리드를 얼룩지게 하십시오. 그런 다음 즉시 3.5 마이크로 리터의 희석 된 단백질을 바르십시오. 그리고 마지막으로, 플런저가 액체 에탄에서 그리드를 블롯 및 플런지 동결시키도록 합니다.
그리드를 그리드 보관 상자로 옮기고 이미징될 때까지 액체 질소 Dewar에 보관합니다. 추출된 미세소관의 품질 및 농도는 Coomassie-염색된 SDS 겔에 의해 평가되었다. BSA 곡선이 있는 P2 레인에서 약 50킬로달톤의 미세소관 대역의 보간에서 파생된 상대 BSA 양의 비선형 회귀선은 밀리리터당 1.42밀리그램의 최종 농도를 나타냅니다.
이것은 두 사람이 분광 광도계로 측정 한 숫자와 잘 일치합니다. 갓 추출한 미세소관은 Cryo-EM 샘플을 만드는 데 사용되었습니다. 미세소관은 현미경 사진에서 손상되지 않고 풍부하게 보입니다.
현미경 사진당 미세소관 밀도는 미세소관이 서로 교차하는 것을 피하기 위해 너무 높아서는 안 됩니다. 깨진 미세소관은 미세소관이 해중합되었거나 미세소관의 농도가 너무 조밀하다는 것을 나타냅니다. MATCAP에 결합된 미세소관은 미세소관 표면에 전자 밀도가 높은 점이 특징인 거친 가장자리를 가지고 있습니다.
MATCAP 결합 및 MATCAP 결합되지 않은 미세소관도 계산된 2D 클래스에서 구별할 수 있습니다. 이 방법으로 Cryo-EM 그리드를 만들면 특정 상호 작용 단백질에 결합된 미세소관의 구조를 연구할 수 있습니다. 이것은 구조 세포 생물학의 메커니즘에 대한 더 나은 이해로 이어질 수 있습니다.
