Vergleichende Studie von Basalmembranmatrizen für die Erhaltung humaner Stammzellen und die Generierung von intestinalen Organoiden

Summary

Organoide sind zu wertvollen Werkzeugen für die Modellierung von Krankheiten geworden. Die extrazelluläre Matrix (EZM) steuert das Zellschicksal während der Organoidgenerierung, und die Verwendung eines Systems, das dem nativen Gewebe ähnelt, kann die Modellgenauigkeit verbessern. Diese Studie vergleicht die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen humanen Darmorganoiden in tierischer EZM und xenofreien Hydrogelen.

Abstract

Die extrazelluläre Matrix (EZM) spielt eine entscheidende Rolle für das Verhalten und die Entwicklung von Zellen. Organoide, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) erzeugt werden, stehen im Fokus vieler Forschungsbereiche. Der Mangel an physiologischen Hinweisen in klassischen Zellkulturmaterialien behindert jedoch eine effiziente iPSC-Differenzierung. Die Einbeziehung von kommerziell erhältlicher EZM in die Stammzellkultur liefert physikalische und chemische Hinweise, die für die Zellerhaltung von Vorteil sind. Im Handel erhältliche Basalmembranprodukte tierischen Ursprungs bestehen aus EZM-Proteinen und Wachstumsfaktoren, die die Zellerhaltung unterstützen. Da die EZM gewebespezifische Eigenschaften besitzt, die das Zellschicksal modulieren können, werden xenofreie Matrizen verwendet, um die Translation in klinische Studien zu übertragen. Während kommerziell erhältliche Matrizen in der hiPSC- und Organoid-Arbeit weit verbreitet sind, wurde die Äquivalenz dieser Matrizen noch nicht untersucht. In dieser Arbeit wurde eine vergleichende Studie zur hiPSC-Erhaltung und zur Bildung von humanen Darmorganoiden (hIO) in vier verschiedenen Matrices durchgeführt: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB) und VitroGel (Matrix 4-XF). Obwohl die Kolonien keine perfekt runde Form aufwiesen, kam es zu einer minimalen spontanen Differenzierung, wobei über 85% der Zellen den Stammzellmarker SSEA-4 exprimierten. Matrix 4-XF führte zur Bildung von runden 3D-Klumpen. Außerdem verbesserte die Erhöhung der Konzentration von Ergänzungs- und Wachstumsfaktoren in den Medien, die zur Herstellung der Matrix 4-XF-Hydrogellösung verwendet wurden, die hiPSC-Expression von SSEA-4 um das 1,3-fache. Die Differenzierung von Matrix-2-AB-erhaltenen hiPS-Zellen führte zu weniger Sphäroidfreisetzungen im Mittel-/Hinterdarmstadium im Vergleich zu den anderen tierischen Basalmembranen. Im Vergleich zu anderen führt die xenofreie Organoidmatrix (Matrix 4-O3) zu einem größeren und reiferen hIO, was darauf hindeutet, dass die physikalischen Eigenschaften von xenofreien Hydrogelen genutzt werden können, um die Organoidbildung zu optimieren. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass Variationen in der Zusammensetzung verschiedener Matrices die Stadien der IO-Differenzierung beeinflussen. Diese Studie schärft das Bewusstsein für die Unterschiede in kommerziell verfügbaren Matrizen und bietet einen Leitfaden für die Matrixoptimierung während der iPSC- und IO-Arbeit.

Introduction

Die extrazelluläre Matrix (EZM) ist ein dynamischer und multifunktionaler Bestandteil von Geweben, der eine zentrale Rolle bei der Regulierung des Zellverhaltens und der Zellentwicklung spielt. Als komplexes Netzwerk bietet es strukturelle Unterstützung, zellhaftende Liganden¹ und die Speicherung von Wachstumsfaktoren und Zytokinen, die die Zellsignalübertragung regulieren. So dient die EZM bei der Wundheilung als Gerüst für wandernde Zellen und als Reservoir für Wachstumsfaktoren, die an der Gewebereparatur beteiligt sind². In ähnlicher Weise kann eine Dysregulation in der EZM zu einer Zunahme des Schweregrads verschied....

Protocol

1. hiPSC-Wartung

ACHTUNG: Alle Arbeiten werden in einer Biosicherheitswerkbank (BSC) nach aseptischen Standardtechniken durchgeführt. Muss die OSHA-Sicherheitsstandards für Labore einhalten, einschließlich der ordnungsgemäßen Verwendung von persönlicher Schutzausrüstung wie Laborkitteln, Handschuhen und Schutzbrillen.

1. Vorbereitung von Matrices, Aliquoten und Zellkulturmedien
   1. Für kommerziell erhältliche Basalmembranen tierischen Ursprungs (BMs; Matrix .......

Discussion

Die Auswahl der optimalen Mikroumgebung für die Arbeit mit Stammzellen und Organoiden ist ein entscheidender erster Schritt beim Einsatz dieser Plattformen für eine Vielzahl von Anwendungen. Unsere repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass Matrix 4-XFO3 in Kombination mit einer höheren Konzentration an Wachstumsfaktoren zu größeren Organoiden führt, was darauf hindeutet, dass die physikalischen Eigenschaften von xenofreien Hydrogelen genutzt werden können, um die Organoidbildung mit diesen Systemen zu optimieren. E.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-Well Plate (Culture treated, sterile)	Falcon	353504
37 °C water bath	VWR
96-well plate	Fisher Scientific	FB012931
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634
Anti-adherence Rinsing Solutio	STEMCELL Technologies	7010
Biological safety cabinet (BSC)	Labconco	Logic
Brightfield Microscope	Echo Rebel	REB-01-E2
BXS0116	ATCC	ACS-1030
Centrifuge with temperature control (4 °C capabilities)	ThermoScientific	75002441
Conical tubes, 15 mL, sterile	Thermo Fisher Scientific	339650
Conical tubes, 50 mL, sterile	Thermo Fisher Scientific	339652
Cultrex RGF BME, Type 2	Bio-techne	3533-005-02
Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME	Bio-techne	3434-010-02
D-PBS (Without Ca++ and Mg++)	Thermo Fisher Scientific	14190144
GeltrexLDEV-Free, hESC-Qualified Reduce Growth Factor	Gibco	A14133-02
GlutaMAX Supplement	Thermo Fischer Scientific	35050-061
Guava Muse Cell Analyzer or another flow cytometry equipment (optional)	Luminex	0500-3115
HEPES buffer solution	Thermo Fischer Scientific	15630-056
Heralcell Vios Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2)	Thermo Scientific	51033775
JMP Software	SAS Institute	JMP 16
MATLAB	MathWorks, Inc	R2022b
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix LDEV free	Corning	356231
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Growth Factor Reduced (GFR) LDEV-free	Corning	354263
mTeSR Plus Medium	STEMCELL Technologies	100-0276
Nunclon Delta surface treated 24-well plate	Thermo Scientific	144530
PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM)	BD Pharmingen	566841
PE Mouse Anti-human CDX2	BD Pharmingen	563428
PE Mouse Anti-human FOXA2	BD Pharmingen	561589
PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-human SSEA4	BD Pharmingen	561565
ReLeSR	STEMCELL	5872
SCTi003-A	STEMCELL Technologies	200-0510
Serological pipettes (10 mL)	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipettes (5 mL)	Fisher Scientific	13-678-11D
STEMdiff Intestinal Organoid Growth Medium	STEMCELL Technologies	5145
STEMdiff Intestinal Organoid Kit	STEMCELL Technologies	5140
Vitrogel Hydrogel Matrix	TheWell Bioscience	VHM01
VitroGel ORGANOID Discovery Kit	TheWell Bioscience	VHM04-K