Name: generation of a human ipsc-based blood-brain barrier chip
Uploaded: 2020-03-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip at JoVE.com

중요한 편집에 대해 소샤나 스벤센 박사님께 감사드립니다. 이 작품은 이스라엘 과학 재단 보조금 에 의해 지원되었다 1621/18, 과학 기술부 (MOST), 이스라엘 3-15647, 재생 의학 교부금 ID ID1-08800, 셔먼 가족 재단, NIH-NINDS 교부금 1UG3NS105703, 및 ALS 협회 보조금 18-SI-389. AH는 발렌베르크 재단(교부금 번호 2015.0178)의 지원을 받았습니다.

1. iPSC 유래 신경 전구 세포 (iNPC)의 생성
<ol><li>아래에 설명된 바와 같이 iPSC 콜로니에서 EZ 구를 생성하고 이전에 출판된20,21,22.<ol>
<li>배양 iPSC 콜로니는 mTESR1 또는 기타 상용 매체에서 지하 막 매트릭스 코팅 6 웰 플레이트(0.5 mg/플레이트)에 대한 합류를 한다(재료 표참조).</li>
		<li>iPSC 배지를 제거하고 EZ 구 배지?...

<ol>
	<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+endogenous+transporters+as+therapeutic+targets:+a+new+model+for+small+molecule+CNS+drug+discovery.">Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).</li><li>Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+blood-brain+barrier:+beyond+the+endothelial+cells.">Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells.</a> Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).</li><li>Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. 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C., Gowing, G., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cGMP-applicable+expansion+method+for+aggregates+of+human+neural+stem+and+progenitor+cells+derived+from+pluripotent+stem+cells+or+fetal+brain+tissue.">A cGMP-applicable expansion method for aggregates of human neural stem and progenitor cells derived from pluripotent stem cells or fetal brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51219 (2014).</li><li>Vatine, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+psychomotor+retardation+using+iPSCs+from+MCT8-deficient+patients+indicates+a+prominent+role+for+the+blood-brain+barrier.">Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).</li><li>Svendsen, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+rapid+and+long+term+growth+of+human+neural+precursor+cells.">A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).</li><li>Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retinoic+acid-enhanced,+multicellular+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+stem+cell+sources.">A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources.</a> Scientific Reports. 4, 4160 (2014).</li><li>Canfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isogenic+blood-brain+barrier+model+comprising+brain+endothelial+cells,+astrocytes,+and+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).</li><li>Jamieson, J. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Fully+Defined+Differentiation+Scheme+for+Producing+Blood-Brain+Barrier+Endothelial+Cells+from+Human+iPSCs.">A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perfused+human+blood-brain+barrier+on-a-chip+for+high-throughput+assessment+of+barrier+function+and+antibody+transport.">A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23 (2018).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+human+organs-on-chips.">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2135 (2013).</li><li>Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li></ol>

NVU의 장기 온 칩 기술과 iPSC 유래 세포의 조합은 인간 BBB의 정확한 모델링에 대한 약속을 보유하고 있습니다. 여기서는 최근에 게시된 iPSC 기반 BBB 칩16의간단하고 강력한 응용을 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 시드 패러다임의 개요와 타이밍은 그림 3에나와 있습니다. BBB 모델링에 적합한 장벽 함수를 획득하고 유지관리하려면 균일한 iBMEC 단층을 생?...

BBB는 순환 혈액에서 CNS를 분리하는 높게 선택적인 방벽입니다. 그것은 잠재적으로 파괴적인 물질에서 중요 한 뇌 기능을 보호, 요인, 그리고 또한 영양소와 뇌 항상성을 유지 하는 데 필요한 다른 대사 산물의 유입을 허용 하는 동안1. BBB는 다세포 NVU로서 골상세포, 성상세포 종보 및 신경 과정이 뇌 미세 혈관 내피 세포(BMECs)와 직접 접촉합니다. 이러한 상호 작용을 통해 BMECs는접합부2,3에의해 지지되는 특수 장벽 특성을 형성할 수 있습니다. 이 방벽의 대형은 분자의 paracellular 통행을 제한합니다, 그러나 능동적으로 CNS로 분자를 수송하기 위하여 편광한 수송자를 포함합니다 또는 혈액으로 다시1. 이러한 독특한 장벽 특성으로 인해 BBB는 바이오 의약품을 뇌로 전달하는 데 큰 장애가 되며 FDA 승인 소분자의 5% 미만이 CNS4에도달할 수 있는 것으로 추정됩니다.
동물 모델은 BBB 개발5에관여하는 BBB 침투 및 분자 메커니즘을 연구하는 데 널리 사용되어 왔다. 동물 모델은 생체 내 복잡한 다세포 환경을 충실하게 나타내지만, BBB 수송기의 발현 및 활성의 차이뿐만 아니라 종에 걸친 기질 특이성의 차이는 종종 인간에게 동물 데이터의 정확한 외삽을배제한다 6. 따라서, 인간 기반 모델은 인간 BBB를 연구하고 CNS를 표적으로 하도록 설계된 약물의 개발에 사용하기 위해 중요하다. 이러한 필요성은 제약 개발 분야에서 생물학적, 인간 특이적 약물의 지배력이 증가함에 따라 더욱 명백해집니다. 축적된 증거는 손상된 BBB가 뇌종양 및 신경질환을 포함하는 다수의 중증 CNS 질환과 연관되어 있음을 시사한다7,8,9. 이러한 질병을 충실하게 반영하는 인간 모델은 1) 약물 개발을 목표로 할 수 있는 새로운 경로를 식별하고 2) CNS 침투를 예측하여 전임상 연구에서 시간과 자원을 줄이고 임상 시험에서 실패율을 감소시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
시험관내 모델은 BMECs와 NVU의 다른 세포 들 사이의 상호 작용을 연구하고 장래 BBB 투과성 약물에 대한 스크린을 수행하기 위해 널리 구현되어 왔다10. 인간 BBB의 주요 측면을 재현하기 위해, 시험관 내 모델은 생리학적으로 관련된 특성을 표시해야 합니다(즉, 낮은 파라셀세포 투과성 및 생리학적으로 관련된 형벌 전기 저항 [TEER] 내피 단층에 걸쳐). 또한, 시험관내 시스템의 분자 프로파일은 대표적인 기능적 수송 시스템의 발현을 포함해야 한다. 전형적으로, 시험관내 모델은 BBB특성(11)을향상시키기 위해 다른 NVU 세포의 조합과 함께 반투과성 막 상에서 배양되는 내피 세포로 구성된다. 이 접근법은 장벽 기능과 분자 투과성을 간단하고 비교적 신속하게 평가할 수 있게 합니다. 이러한 세포 기반 BBB 모델은 외과 적 절제 또는 불멸의 BMEC 라인으로부터 분리된 세포를 포함하는 동물 또는 인간 세포 공급원으로 확립될 수 있다.
최근, 인간 다능성 세포를 BMECs로 분화하는 프로토콜이 시험관 내 인간 BBB모델(12,13)에대한 매력적인 공급원으로 도입되었다. 유도된 만능 줄기 세포(iPSC)-유래 BMECs(iBMECs)는 확장성이 높고, 인간 BBB의 중요한 형태학적 및 기능적 특성을 입증하고, 환자의 유전학을 수행한다. 문화에서 iBMECs는 단단한 접합 마커를 표현하고 생체내 접합 단지에 표시하는 단층을 형성합니다. 이들 세포는 또한 BBB 포도당 수송기, 포도당 수송기 1(GLUT1)을 포함하는 BBB 마커를 발현한다. 중요한 것은, 인간 BMECs에 대한 다른 대체 세포 소스와는 달리, iBMECs는 생체 내 측정값과 높은 값으로 장벽 특성을획득,basolateral 축을 따라 편광, 및 기능성 유출 펌프를 표현. 더욱이, 다양한 피험자들로부터의 iPSCs의 사용은 모두 1) 개인화된 의학 방식으로 BBB의 양상을 시험할 수 있는 기회를 환영하고 2) NVU의 추가적인 세포 유형을 생성하기 위한 유연한 공급원을 제공한다. 개인화된 BBB 칩을 만들기 위하여 이 세포를 동위 원성 세포 근원에서 생성하는 것은 또한 임상 연구 결과에서 관찰된 처리에 저항 또는 손상한 반응에 대한 주요 원인인 약 반응에 있는 개별적인 다름을 이해하는 것을 도울 것입니다.
접시 나 반 투과성 트랜스웰 인서트에 단일 레이어로 iBMECs를 사용하는 것은 BBB 모델링을위한 강력한 접근 방식을 나타냅니다. 이러한 시스템은 견고하고 재현 가능하며 비용 효율적인 경향이 있습니다. 또한 TEER 및 투과성과 같은 기능 분석은 비교적 간단하게 수행할 수 있습니다. 그러나, 2차원(2D) 시스템은 생체 내 조직의 3D 특성을 재현하지 못하고, 혈액 및 혈액 세포를 순환시킴으로써 제공되는 생리학적 전단 응력이 부족하다. 이것은 본질적인 BBB 속성 및 기능을 개발하고 유지하기 위하여 이 모형에 있는 관 내피의 기능을 제한합니다.
살아있는 세포에 의해 줄 지어 있는 마이크로 엔지니어링 시스템은 오르간 온 칩에게 불린 개념에 있는 각종 기관 기능을 모델링하기 위하여 실행되었습니다. 생체외 다세포 구조, 조직-조직 인터페이스, 물리 화학 적 미세 환경 및 혈관 관류를 재현함으로써 이러한 마이크로 엔지니어링 플랫폼은 조직 및 장기 기능 수준을 생성할 수 없습니다. 기존의 2D 배양 시스템. 그(것)들은 또한 생체 내 조직 및 기관 문맥에 있는 살아있는 세포와 유사한 생화확적인, 유전 및 신진 대사 단면도의 고해상도, 실시간 화상 진찰 및 분석을 가능하게 합니다. 그러나 오르간 온 칩의 특별한 과제는 이러한 마이크로 엔지니어링 칩의 설계, 제작 및 적용에는 생물학적 지향적인 학술 실험실에서 일반적으로 부족한 전문 엔지니어링 전문 지식이 필요하다는 것입니다.
우리는 최근에 개인화 된 BBB 칩 모델15,16을생성하기 위해 iPSC 및 오르간 온 칩 기술을 결합했습니다. 기술적인 과제를 극복하기 위해 시판되는 Chip-S1은 간단하고 견고한 방식으로 칩의 유지관리를 자동화하도록 설계된 계측기인 배양 모듈과 함께 사용됩니다(Emulate Inc.). BBB 칩은 신경 세포와 내피 세포 사이의 상호 작용을 재현하고 통합 금 전극17과사용자 정의 만든 장기 칩에 의해 측정되는 생리적으로 관련된 TEER 값을 달성한다. 또한 BBB 칩은 낮은 세포 투과성을 표시하고, 기관 수준에서 염증 신호에 반응하고, 활성 유출 펌프를 표현하며, 수용성 바이오마커 및 바이오 의약품의 예측 수송을 나타냅니다. 특히, 여러 개인으로부터 생성된 BBB 칩은 건강한 개인과 신경질환 환자 사이의 예상 기능적 차이를포착한다 15.
아래에 자세히 설명된 프로토콜은 동적 흐름 조건에서 인간 iPSC 기반 BBB 칩의 생성을 위한 신뢰할 수 있고 효율적이며 재현 가능한 방법을 설명합니다. BBB 칩또는 샘플링 유출물에서 직접 수행할 수 있는 분석 유형 및 종점 분석에 대한 지침이 제공됩니다. 따라서, 프로토콜은 인간 관련 모델에서 생물학적 및 기능적 특성 및 반응을 평가하기 위해 적용될 수 있는 기술의 스펙트럼을 보여준다.
iPSC 기반 BBB 칩에 대한 간략한 설명은 여기에 제공됩니다. 인간 iPSCs는 처음에 조직 배양 플라스크에서 EZ 구라고 불리는 신경 전구의 자유 부동 응집체로서 분화되고 전파됩니다. Chip-S116,18,19의 최상위 채널은 칩의 "뇌 측"을 형성하는 해리된 EZ 구체로 시드되며, 세포는 7일 동안 신경 전구 세포(iNPC), iAstrocytes 및 iNeurons의 혼합 배양으로 분화됩니다. 인간 iPSCs는 또한 iBMECs로 조직 배양 판에서 분화됩니다. 칩의 하단 채널은 iBMECs로 시드되어 내피 튜브를 형성하기 위해 발달함에 따라 "혈액 측"을 형성합니다(그림 1). 상하 채널 1을 분리하는 다공성 세포 외 매트릭스(ECM) 코팅 멤브레인은 채널과 2 사이의 세포 간 상호 작용의 형성을 허용하며, 사용자는 기존의 광 현미경을 사용하여 어느 채널에서든 투과성 세포 및 이미지 세포를 실행할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td>Dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bfgf</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip-S1</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>Chip-S1</td>
			<td>Organ-Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-FITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31330038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent 1 (ER-1)</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>ER-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent 2 (ER-2)</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>ER-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLUT-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-11315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hBDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOSR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies, Inc.</td>
			<td>85851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>01-340-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Alternate media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP)</td>
			<td>Biomedical Technologies</td>
			<td>J64483AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33-9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;III-tubulin (Tuj1&#945;)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a human ipsc-based blood-brain barrier chip

혈액 뇌 장벽 (BBB) 신경 혈관 단위에 의해 형성 된다 (NV) 그 중추 신 경계를 보호 (CNS) 미묘한 뇌 기능을 방해할 수 있는 혈액에서 발견 하는 요인의 범위에서. 이와 같이, BBB는 CNS에 치료제의 전달에 주요 장애물이다. 축적 된 증거는 BBB가 신경 질환의 발병과 진행에 중요한 역할을한다는 것을 시사합니다. 따라서, CNS 표적 약물의 침투를 예측할 수 있을 뿐만 아니라 건강과 질병에 있는 BBB의 역할을 해명할 수 있는 BBB 모형을 위한 엄청난 필요가 있습니다.
우리는 최근에 인간에게 완전히 개인화된 BBB 칩을 생성하기 위하여 기관 온 칩 및 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC) 기술을 결합했습니다. 이 새로운 플랫폼은 인간 BBB를 통해 약물 및 분자 수송의 예측에 적합한 세포, 분자 및 생리학적 특성을 표시합니다. 또한 환자 별 BBB 칩을 사용하여 신경 질환 모델을 생성하고 개인화 된 예측 의학 응용 프로그램의 잠재력을 입증했습니다. 여기에 제공된 iPSC 유래 BBB 칩을 생성하는 방법을 보여주는 상세한 프로토콜이 제공되며, iPSC 유래 뇌 미세 혈관 내피 세포(iBMECs)의 분화로 시작하여 신경 전구를 함유하는 혼합 신경 배양물의 결과로 시작되며, 차별화 된 뉴런, 및 성상 세포. 또한 조절된 층류 하에서 장기 칩 내로 세포를 시드하고 BBB 칩을 배양하는 절차도 기술되어 있다. 마지막으로, BBB 칩 분석에 대한 상세한 설명은 칩 내의 세포 유형의 조성을 결정하기 위한 면역세포화학적 방법뿐만 아니라 약물 및 분자 투과성을 평가하기 위한 파라셀룰러 투과성 분석법을 포함한다.

그림 6A, B,C는 "혈액 측"하단 채널에 "뇌 측"상단 채널및 iBMECs에 EZ 구체시드 BBB 칩을 나타냅니다. iBMECs는 먼저 시드하고 EZ 구체를 시드 한 후 하룻밤 부착 할 수 있었습니다. 칩은 7 일 동안 매일 미디어 교체와 정적 조건에서 배양되었다. BBB 칩은 RT에서 4% PFA를 사용하여 10분 동안 고정하고 DPBS로 3x 세척하였다. 면역세포화학은 1) 신경 전구 세포에 대한 마커로서 1)...

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Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

혈액 뇌 장벽 (BBB) 단단히 뇌 항상성을 조절 하는 다세포 신경 혈관 단위. 인간 iPSCs와 오르간 온 칩 기술을 결합하여 질병 모델링 및 CNS 약물 침투성 예측에 적합한 맞춤형 BBB 칩을 생성했습니다. BBB 칩의 생성 및 작동에 대해 상세한 프로토콜이 설명된다.

인간 iPSC 기반 혈액-뇌 장벽 칩 생성

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

이 프로토콜은 분화 유도 된 만능 줄기 세포가 중추 신경계 약물 투과성을 예측하고 신경 장애를 연구하는 데 사용할 수있는 완전히 인간, 개인화 된 미세 유체 혈액 - 뇌 장벽을 생성하기 위해 장기 온 칩에 시드 될 수있는 방법을 보여줍니다. 시판되는 장기 온 칩을 사용하여, 우리는 어떤 생물학적 지향적인 실험실이 개인화된, 미세 유체 혈액-뇌 장벽-온 칩을 생성하기 위해 이 기술을 어떻게 사용할 수 있는지 를 보여줍니다. 증거를 축적하는 것은 BBB가 유전 신경 질환을 가진 개별의 iPSCs에서 파생된 개인화된 BBB 칩을 생성해서 신경학상 질병에 있는 역할을 한다는 것을 건의합니다.건강과 질병에 있는 BBB의 역할을 공부하는 것이 가능할 것입니다. 이 방법은 또한 제약 회사에 유용 할 수 있습니다, 이는 인간의 뇌에 후보 신경 약물의 침투성을 선별하기 위해이 인간의 BBB 플랫폼을 사용할 수 있습니다. 장기 온 칩 기술의 적용에는 일반적으로 특수 엔지니어링 기술이 필요합니다.상업적으로 이용 가능한 플랫폼을 사용하면 생물학적 지향 실험실에서 이 기술을 사용할 수 있습니다. 먼저 준비된 칩이 들어 있는 접시를 생물안전 캐비닛에 가져오십시오. P200 파이펫을 사용하여 200 마이크로리터의 신경 분화 매체를 입구에 추가하고 콘센트에서 액체를 당겨 두 채널을 부드럽게 세척하십시오.포트와의 접촉을 피하고 칩 표면에서 과도한 미디어 물방울을 조심스럽게 흡인시합니다. 균일한 세포 현탁액을 보장하기 위해 셀 현탁액을 부드럽게 교반합니다. iPSC 유래 신경 전구세포를 상부 채널에 시드하여 뇌 측을 생성하려면, 상단 채널 입구에 밀리리터당 6개의 세포에 10~6개의 세포에 10~100마이크로리터의 농도로 세포 현탁액30 내지 100 마이크로리터를 포함하는 P200 팁을 추가하고, 파이펫으로부터 팁을 부드럽게 풀어놓는다.빈 P200 파이펫을 가지고 플런저를 누르고, 상단 채널 콘센트에 삽입하고, 팁을 통해 단일 셀 서스펜션을 조심스럽게 당깁니다. 칩을 현미경으로 전송하여 톱 채널 내의 세포의 파종 밀도 및 균질분포를 확인합니다. 세포 밀도를 20% 커버리지로 확인한 후 즉시 칩을 섭씨 37도에서 2시간 동안 인큐베이터에 넣습니다.그 후, 입구에 신선한 신경 분화 매체를 추가하고 콘센트에서 파이펫을 통해 액체를 당겨 부착하지 않는 세포를 씻어. 매일 신경 분화 매체 교체와 함께 37섭씨에서 세포를 유지합니다. iNPC가 부착한 후 또는 파종 후 다음 날에 준비된 칩이 들어 있는 접시를 생물 안전 캐비닛에 가져온다.내피 세포 배지 200 마이크로리터로 바닥 채널을 부드럽게 세척합니다. 포트와의 접촉을 피하고 칩 표면에서 과도한 내피 세포 매체의 물방울을 조심스럽게 흡인하여 두 채널모두에 배지를 두십시오. 균일한 세포 현탁액을 보장하기 위해 셀 현탁액을 부드럽게 교반합니다.P200 파이펫을 사용하여, iPSC 유래 뇌 미생물 내피 세포 현탁액의 30~ 100 마이크로리터를 밀리리터당 6개의 세포에 14-20배 10배의 농도로 끌어내고, 팁을 바닥 채널 입구에 놓는다. 기능 장벽 특성을 달성하기 위한 가장 중요한 단계는 뇌 미세 혈관 내피 세포의 파종입니다. 장기 칩 내의 균일 한 분포를 확인하기 위해 거품 형성을 피하기 위해 적절한 밀도로 세포를 종자 하는 것이 중요합니다.빈 팁으로 P200 파이펫의 플런저를 누르고, 하단 채널 콘센트에 삽입하고, 천천히 파이펫 플런저를 방출하여 하단 채널을 통해 단일 셀 서스펜션을 조심스럽게 당깁니다. 칩 표면에서 과도한 셀 서스펜션을 흡인시합니다. 인렛 및 콘센트 포트와의 직접 접촉을 방지하여 셀 서스펜션이 채널에서 흡습되지 않도록 하십시오.칩을 현미경으로 전송하여 파종 밀도를 확인합니다. 하단 채널은 사이에 관찰 가능한 간격이 없는 셀로 채워져 있습니다. 올바른 세포 밀도를 확인한 후 나머지 칩에 셀을 시드합니다.하단 채널 위에 있는 다공성 막에 세포를 부착하려면 각 칩을 반전시키고 칩 요람에 놓습니다. 150mm 접시 안에 멸균 DPBS를 함유한 작은 저수지를 배치하여 세포에 습도를 제공합니다. 칩을 섭씨 37도에서 약 3시간 동안 또는 하단 채널의 세포가 부착될 때까지 배양합니다.iPSC 유래 뇌 미생물 내피 세포가 부착되면 칩을 똑바로 똑바로 세워 하단 채널의 하단 부분에 세포 부착을 허용합니다. iPSC 유래 뇌 미생물 내피 세포의 48시간 후 시축은 내피 세포 중의 온도를 1시간 동안 섭씨 37도에서 따뜻하게 하여 평형화한다. 그런 다음 진공 구동 여과 시스템 하에서 배양하여 배지를 15분 동안 분해합니다.다음으로 휴대용 모듈 포장 및 트레이의 외관을 70%에탄올로 소독하고 닦아 생물안전 캐비닛으로 옮길 수 있습니다. 패키지를 열고 모듈을 트레이 의 뒤쪽쪽으로 저장소로 오리엔트에 넣습니다. 각 입구 저수지에 미리 평형되고 따뜻한 매체의 파이펫 3 밀리리터.내피 세포 배양 배지를 상부 채널의 상부 채널 입구 저장소에 하단 채널 및 신경 분화 매체의 입구 저장소에 추가합니다. 그런 다음, 각 콘센트 저장소에 미리 평형되고 따뜻한 매체의 파이펫 300 마이크로리터가 각 콘센트 포트 바로 위에 있습니다. 각 트레이에 최대 6개의 휴대용 모듈을 배치합니다.트레이를 인큐베이터에 가져오고 트레이 핸들이 바깥쪽을 향하여 배양 모듈에 완전히 밀어 넣습니다. 배양 모듈에서 프라임 사이클을 선택하고 실행합니다. 인큐베이터 도어를 닫고 배양 모듈이 휴대용 모듈을 약 1분 동안 프라임할 수 있도록 합니다.상태 표시줄이 준비된 경우 프라이밍 주기가 완료됩니다. 배양 모듈에서 트레이를 제거하고 생물 안전 캐비닛에 가져옵니다. 생체 안전 캐비닛의 각 휴대용 모듈의 아래쪽을 검사하여 휴대용 모듈이 성공적으로 준비되었는지 확인합니다.네 개의 포트에서 작은 물방울이 있는 것을 찾습니다. 휴대용 모듈에 물방울이 표시되지 않으면 해당 모듈에서 프라임 사이클을 다시 실행합니다. 콘센트 포트에서 더 자주 발생하는 용지에 용지가 떨어지면 트레이를 70%에탄올로 청소하십시오.다음으로 각 칩의 두 채널을 따뜻하고 평형된 세포 별 배양 배지로 부드럽게 세척하여 채널의 가능한 거품을 제거하고 각 입구및 콘센트 포트 의 상단에 작은 미디어 방울을 놓습니다. 휴대용 모듈에 캐리어가 있는 칩을 삽입하고 각 트레이에 최대 6개를 배치합니다. 트레이를 배양 모듈에 삽입합니다.배양 모듈에 유량 및 스트레치와 같은 적절한 장기 칩 배양 조건을 프로그래밍합니다. 약 2시간이 걸리는 조절 주기가 완료되면 프로그래밍된 조건이 시작됩니다. 그 후, 배양 모듈은 사전 설정된 장기 칩 배양 조건에서 흐름을 시작합니다.iPSC 기반 혈액-뇌 장벽 칩에 면역 세포 화학 7 일 후 종자 후 S100 베타 양성 성상 세포, 네신 양성 신경 전구 세포뿐만 아니라 GFAP 양성 성구 세포, 베타 III 투덜인 양성 뉴런을 포함하여 상위 뇌 측 채널에서 혼합 신경 세포 집단으로 분화 된 EZ 구체를 보여줍니다. IPSC 유래 뇌 미생물 내피 세포는 바닥 혈액 측 채널에서 시드GLUT-1 및 PECAM-1을 발현시켰다. 혈액-뇌 장벽 칩 투과성의 평가는 iPSC 유래 뇌 미생물 내피 세포와 EZ 구체로 시드된 장기 칩이 iPSC 유래 뇌 미생물 내피 세포로 시드된 장기 칩에 비해 단단한 장벽을 가졌다는 것을 보여준다.EZ 구체만으로 시드된 오르간 칩은 장벽 특성을 표시하지 않았습니다. 채널의 초기 표면 처리부터 매일 중간 스위칭까지 채널의 버블 형성을 피하십시오. 표면 활성화 시약, 세포외 매트릭스 또는 세포 함유 매체가 채널을 통해 삽입되어야 하는 프로토콜의 단계 전반에 걸쳐, 거품이 발견되지 않았는지 신중하게 확인하는 것이 매우 중요합니다.투과성 분석은 후보 약물의 인간의 뇌 침투성을 평가하기 위해 수행 될 수있다. 이 접근은 잠재적인 치료치료를 시험하기 위해 봉사할 수 있습니다. iPSC 기반 BBB 칩의 적용은 다양한 신경 질환에서 BBB의 역할을 연구 할 수 있습니다.미래에 이러한 플랫폼은 예측, 개인화 된 의학 응용 프로그램에 유용 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

천장 문화 성숙한 지방 세포의 탈분화를 통해 인간 된 지방 줄기 세포의 생성

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

연구

발생학

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

헤어 유래 각질 세포를 사용하여 통합없는 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

약화 된 인간의 진피를 사용하여 유전자 변형의 Organotypic 피부 문화의 생성

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

인간의 흑색 종 종양 침윤 림프구에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

정의 및 간세포와 같은 세포의 확장 성 생성 인간 다 능성 줄기 세포에서

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

IPSC 파생 된 인간의 두뇌 Organoids의 세대는 초기 신경 발달 장애를 모델링하기

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

생성 및 기본 인간 Keratinocytes 성인 피부에서의 경작

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

인간의 장 Organoids에 상피 장벽 침투성의 실시간 측정

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

초파리 멜라노가스터의 혈액-뇌 장벽 무결성에 대한 분석

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

다세포 인간 1 차 자궁 내막 오르가노이드의 생성

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...