بروتوكول لدينا تمكن من دراسة التهاب اللثة في فترة ما بينية في نموذج الماوس يمكن الوصول إليها وتسيطر عليها. لذلك، هذا البروتوكول له مزايا على عينات المريض أو نماذج في المختبر. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أن الماوس قد درس جيدا وأن الطريقة بسيطة من الناحية التقنية من حيث متطلبات المرفق وفعالة من حيث التكلفة.
نظرًا لأن هذا الإجراء يمثل تحديًا نظرًا للأبعاد الصغيرة للأسنان ، فمن المفيد تصور الإجراء لمعرفة مكان وأداء هذه التقنية. بعد التأكد من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع قدم، ضع الماوس على الجانب اليد المهيمن على سطح رغوة البوليسترين المُغلقة والخلية وتأمين الكفوف مع الشريط. باستخدام شريط مطاطي واحد لكل زوج من القناطر، والإبر طويلة مُرَكَّزة على سطح رغوة البوليسترين المُغلقة، دعامة الفم المفتوحة.
استخدام ملقط مغلقة مسجلة على الرغوة لسحب الخد الأيمن. ووضع الرغوة والفأر تحت المجهر ومصدر الضوء. ثم، تراجع اللسان باستخدام ملعقة الأسنان واستخدام إبرة قياس 27 لحقن 25 إلى 50 ميكرولترات من مخدر موضعي في حظيرة الموكوبوكية المجاورة لأول مضرور المني.
وينبغي ملاحظة تورم الأنسجة حول موقع الحقن. لفضح اللب، واستخدام أي محرك الأسنان مناسبة مجهزة جولة، وارتفاع سرعة الماس 0.8 ملليمتر الأسنان بور بسرعة 800 طلقة في الدقيقة الواحدة، لحفر الجزء الانسداد من الضرس المندي الأيمن الأول حتى قرون اللب مرئية من خلال العاج. استخدام ملف K أو H، رقم ثمانية أو رقم 10 لثقب اللب وكسر العاج التي تغطي قرنية اللب mesial وs distal للسماح بإدراج الملف في قرون.
مواصلة العمل مع الملفات داخل اللب أعمق قدر ممكن مع توسيع الفتحات مع الملفات، ويلاحظ عادة النزيف من اللب جولة حواف حادة من الأسنان مع البور وإزالة الأسنان من انكل للحد من الألم أثناء التجربة. استخدام فرشاة صغيرة لتنظيف أي حطام. وترك المقابلة الاضلاعية أول مضرس الماندي كتحكم.
في الأيام الثلاثة الأولى بعد الإجراء ، وزن الحيوانات وحقن 0.1 ملليغرام لكل كيلوغرام من البوبرينورفين intraperitoneally مرة واحدة في اليوم. الاستمرار في مراقبة الحيوانات على مدى الأيام ال 42 المقبلة عن طريق وزنها والتقييم السلوكي العام مرتين إلى ثلاث مرات في الأسبوع. وتوصيل كريات الطعام المخففة بالماء في طبق بيتري على أرضية القفص طوال فترة المتابعة.
في نهاية التجربة، استخدم المقص الجراحي واللقط لجمع الجزء من الفك الذي يتضمن الأضراس الثلاثة على الجانبين المعالج وغير المعالجين. واستخدام ملقط لتقشير أكبر قدر ممكن من الأنسجة الرخوة، وترك معظمها العظام والأسنان على العينات. شطف الأنسجة لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني.
قبل التثبيت في أربعة في المائة شبه شكلي لمدة 24 إلى 48 ساعة. ثم شطف العينات ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني جديد. بالنسبة للتصوير المقطعي المحوسب الدقيق، أو التحليل المقطعي المجهري يضع الأنسجة المحصودة في أنبوب قطره 12 ملليمترًا يحتوي على 1.5 ملليلتر من PBS على مرحلة الماسح الضوئي.
مع العينات الموجهة بحيث السطوح buccal أو اللغات من الأسنان والجذر وضع موازية لأدنى الأنبوب. استخدم إسفنجة لفصل العينات. وتغطي الجزء العلوي من أنبوب مع فيلم مرنة.
حدد ملف التحكم، وتعيين الطاقة إلى 70 كيلوفولت، وكثافة إلى 114 أمبير الصغرى، والقرار إلى ستة ميكرومتر مكعب Voxel الحجم. انقر فوق عرض الكشفية. عند ظهور الصورة، انقر فوق Reference-Line ووضع علامة على مساحة العينات للمسح الضوئي، والنقر فوق إضافة مسح ضوئي بعد كل عينة.
عند وضع علامة على كافة النماذج، انتقل إلى قائمة المهام، وحدد بدء مهام التفاعل. لتكفاف شرائح الأشعة المقطعية الدقيقة، حدد الشريحة التي تمثل منتصف تقريبي من السن، حيث اللب الإكليلية، اللب المشعر لكلا القناةين، وكلا من القفرات apical موجودة. انقر فوق لوحة كفاف، وبدءا من نقطة القاصي من قمة الجذر القعد، علامة على coronally الحدود apical إلى منطقة apical شفافة شعاعي، من خلال الحدود mesial من قمة الجذر mesial، بعد الحدود البعيدة من الجذر ميصال، والحدود mesial من الجذر القعد، من خلال منطقة الفراء.
انسخ ولصق المحيط الناتج، واضبط الكنتوري وفقًا لذلك إلى خمس شرائح موضوعة على جانبي الشريحة الوسطى. لحساب حجم نسيج كفاف ملحوظ لكل عينة، ضمن تقييم الدقيقة CT، حدد المهمة وانقر فوق 3D-التقييم. ثم، في إطار التقييم ثلاثي الأبعاد، انقر فوق تحديد وحدد فلتر لحساب حجم الأنسجة.
في نهاية التحليل المجهري، نقل الأنسجة من الماسح الضوئي إلى أنبوب جهاز طرد مركزي صغير يحتوي على ملليلتر واحد من EDTA لمدة 10 أيام. في نهاية عملية إزالة الاحتقان، ضع العينات في شرائط النسيج التي تحتوي على تركيزات الإيثانول، لمدة ساعة واحدة لكل تركيز. بعد الغمر الإيثانول الثاني، نقل العينات إلى إكسيلين لمدة ساعتين الغمر ساعة واحدة، قبل نقل الكاسيت إلى 60 درجة مئوية البارافين السائل في غطاء محرك السيارة الكيميائية بين عشية وضحاها للسماح للزيلين لتتبخر.
في صباح اليوم التالي، ضع العينات المجففة مع التاج والجذور الموجهة بالتوازي مع الجزء السفلي من القالب، في آلة حجب النسيج لتضمين العينات في البارافين. للحصول على المقاطع، تأمين عينة كتلة البارافين على كتلة قطع ميكرونون، وتقليم العينة حتى يتم التوصل إلى الأنسجة ذات الاهتمام. عندما يكون أي جزء من السن مرئيًا ، ابدأ في الحصول على ستة أقسام سميكة من ميكرومتر ، وضبط زاوية القطع حتى يتم الحصول على أقسام القوس التي تشمل اللب التاجي والراديلي والحصانات apical.
هنا ، يتم عرض الفك السفلي بأكمله. التكبير من المولى أول الحق المعالجة، يسمح مراقبة التعرض لكل من قرون اللب الوسيم وstal ومدخل القنوات. التصوير المقطعي المجهري يسمح بالتصور من التعرض اللب mesial، وmisial وsiapical المناطق من resorbtion العظام.
في الواقع ، يتم قياس إعادة نشوة العظام النخاعية الكبيرة في حجم الأنسجة في الأسنان المعالجة ، مقارنة بالضوابط. التحليل النسيجي يشير إلى أن في الأسنان المعالجة، ولب الأسنان نفسه يقدم نخر، والتي يمكن ملاحظتها بوضوح بعد تلطيخ H و E مقارنة بالأنسجة اللب المنظم التحكم. بالإضافة إلى ذلك ، والأهم من ذلك ، في المنطقة المحيطة بالأسنان المعالجة ، لوحظ آفة عنيفة تتكون من خلايا مناعية ، وهي غائبة في الأسنان المسيطرة.
فمن الأهمية بمكان لوضع الماوس بشكل صحيح أثناء التعرض لب كما تحديد المواقع الصحيحة تمكن من الوصول الجيد إلى فم الحيوان والنتائج المثلى. يمكن إجراء طرق إضافية لتحليل الالتهابات شبه نمطية مثل تلطيخ الأنسجة المناعية والفاكس والتحليل الجزيئي التفصيلي للخلايا بعد هذا البروتوكول. هذا البروتوكول مهم ، ليس فقط لأبحاث الأسنان ، ولكن أيضًا للأبحاث المناعية ، لأنه يوفر نموذجًا للالتهابات المحلية المستحثة مع التحكم الداخلي المدمج.
