Notre protocole permet l’étude de la parodontite périapicale dans un modèle de souris accessible et contrôlé. Par conséquent, ce protocole présente des avantages par rapport aux échantillons de patients ou aux modèles in vitro. Les principaux avantages de cette technique sont que la souris a été bien étudiée et que la méthode est techniquement simple en termes d’exigences de l’installation et est rentable.
Comme cette procédure est difficile en raison des petites dimensions des dents, il est bénéfique de visualiser la procédure pour en apprendre davantage sur le positionnement et la performance de la technique. Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des pieds, placez la souris sur le côté dominant de la main sur une surface de mousse de polystyrène extrudé à cellules fermées et fixez les pattes avec du ruban adhésif. À l’aide d’un seul élastique par paire d’incisives et de longues aiguilles épinglées sur la surface de mousse de polystyrène extrudé à cellules fermées, ouvrez la bouche.
Utilisez des forceps fermés scotchés à la mousse pour rétracter la joue droite. Et placez la mousse et la souris sous un microscope et une source de lumière. Ensuite, rétractez la langue à l’aide d’une spatule dentaire et utilisez une aiguille de calibre 27 pour injecter de 25 à 50 microlitres d’anesthésique local dans le pli mucobuccal adjacent à la première molaire mandibulaire.
L’enflure des tissus autour du site d’injection doit être observée. Pour exposer la pulpe, utilisez n’importe quel moteur dentaire approprié équipé d’un diamant rond à grande vitesse 0,8 millimètre bur dentaire à une vitesse de 800 tours par minute, pour percer la partie occlusale de la première molaire mandibulaire droite jusqu’à ce que les cornes de pulpe sont visibles à travers la dentine. Utilisez un fichier K ou H, numéro huit ou numéro 10 pour percer la pulpe et casser la dentine couvrant les cornes de pulpe mésiale et distale pour permettre l’insertion du fichier dans les cornes.
Continuer à travailler avec les fichiers à l’intérieur de la pulpe aussi profondément que possible tout en élargissant les ouvertures avec les fichiers, saignement de la pulpe est généralement observé autour des bords tranchants de la dent avec le bur et enlever la dent de l’isolement pour réduire la douleur pendant l’expérience. Utilisez une micro brosse pour nettoyer les débris. Et laissez la gauche contralatérale première molaire mandibulaire comme un contrôle.
Pendant les trois premiers jours suivant l’intervention, pondez les animaux et injectez 0,1 milligramme par kilogramme de buprénorphine intrapétoneally une fois par jour. Continuer à surveiller les animaux au cours des 42 prochains jours en pesant et l’évaluation comportementale générale deux à trois fois par semaine. Et livrer des boulettes de nourriture ramollies avec de l’eau dans une boîte de Pétri sur le sol de la cage tout au long de la période de suivi.
À la fin de l’expérience, utilisez des ciseaux chirurgicaux et des forceps pour recueillir la partie de la mâchoire qui comprend les trois molaires sur les côtés traités et non traités. Et utilisez des forceps pour décoller autant de tissus mous que possible, laissant principalement des os et des dents sur les échantillons. Rincer brièvement le tissu dans PBS.
Avant fixation en paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 à 48 heures. Rincez ensuite les échantillons trois fois dans du PBS frais. Pour la tomographie micro-calculée, ou analyse micro-CT placer les tissus récoltés dans un tube de 12 millimètres de diamètre contenant 1,5 millilitres de PBS sur l’étape du scanner.
Avec les échantillons orientés de sorte que les surfaces buccales ou linguales de la dent et de la racine se couchent parallèlement au fond du tube. Utilisez une éponge pour séparer les échantillons. Et couvrir le haut du tube avec un film flexible.
Sélectionnez le fichier de commande, et réglez l’énergie à 70 kilovolts, l’intensité à 114 micro amplis, et la résolution à une taille voxel en cubes de six micromètres. Cliquez sur Scout-View. Lorsque l’image apparaît, cliquez sur Référence-Ligne et marquez la zone des échantillons pour la numérisation, en cliquant sur Ajouter l’analyse après chaque échantillon.
Lorsque tous les échantillons ont été marqués, allez à la liste de tâches et sélectionnez Démarrer les tâches d’interaction. Pour le contour des tranches de Micro-CT, sélectionnez la tranche qui représente le milieu approximatif de la dent, dans laquelle la pulpe coronale, la pulpe radiculaire des deux canaux, et les deux foramens apical sont présents. Cliquez sur le panneau de contour, et à partir du point distal de l’apex de racine distale, marquez la frontière apical coronally à la zone apical radiale de paque, par la frontière mésiale de l’apex mésial de racine, suivant la frontière distale de la racine mésiale, et la frontière mesiale de la racine distale, par la région de furcation.
Copiez et coller le contour qui en résulte, et ajustez le contour en conséquence en fonction de cinq tranches placées de chaque côté de la tranche du milieu. Pour calculer le volume tissulaire du contour marqué pour chaque échantillon, dans le cadre de l’évaluation micro-CT, sélectionnez Tâche et cliquez sur 3D-Evaluation. Ensuite, dans la fenêtre de l’évaluation 3D, cliquez sur Sélectionnez et sélectionnez un filtre pour calculer le volume des tissus.
À la fin de l’analyse micro-CT, transférer les tissus du scanner à un tube de micro centrifugeuse contenant un millilitre d’EDTA pendant 10 jours. À la fin de la décalcification, placez les échantillons dans des cassettes histologiques contenant des concentrations croissantes d’éthanol, pendant une heure par concentration. Après la deuxième immersion d’éthanol, transférer les échantillons dans du xylène pour deux immersions d’une heure, avant de transférer les cassettes dans de la paraffine liquide de 60 degrés Celsius dans une hotte chimique pendant la nuit pour permettre au xylène de s’évaporer.
Le lendemain matin, placez les échantillons déshydratés avec la couronne et les racines orientées parallèlement au fond du moule, dans une machine de blocage histologique pour intégrer les échantillons dans la paraffine. Pour obtenir des sections, fixez l’échantillon de bloc de paraffine sur le bloc de coupe de microtone, et coupez l’échantillon jusqu’à ce que le tissu d’intérêt soit atteint. Quand n’importe quelle partie de la dent est visible, commencez à obtenir six sections épaisses de micromètre, ajustant l’angle de coupe jusqu’à ce que les sections sagittales qui incluent la pulpe coronale et radiculaire et le foramen apical soient obtenues.
Ici, toute une mandibule traitée est montrée. Le grossissement de la première molaire droite traitée permet d’observer l’exposition des cornes de pâte mésiales et distales et l’entrée des canaux. La formation image de micro-CT permet la visualisation de l’exposition de pulpe mésiale, et des secteurs radiolucent periapical mésiaux et distals de la résorbtion d’os.
En effet, une résorbation périapical significative d’os du volume de tissu est mesurée dans les dents traitées, comparée aux contrôles. L’analyse histologique indique que dans la dent traitée, la pulpe dentaire elle-même présente la nécrose, qui peut être observée clairement après la coloration de H et E comparée au tissu organisé de pulpe de contrôle. En outre, et surtout, dans la région périapical de la dent traitée, une lésion périapical composée des cellules immunisées est observée, qui est absente dans les dents témoins.
Il est essentiel de positionner correctement la souris pendant l’exposition à la pulpe car un positionnement correct permet un bon accès à la bouche de l’animal et des résultats optimaux. D’autres méthodes d’analyse périapical d’inflammation telles que la coloration et le fax immunohistochimiques de tissu et l’analyse moléculaire détaillée des cellules peuvent être exécutées suivant ce protocole. Ce protocole est significatif, non seulement pour la recherche dentaire, mais aussi pour la recherche immunologique, car il fournit un modèle pour l’inflammation induite locale avec un contrôle interne intégré.
