Unser Protokoll ermöglicht das Studium von periapischen Parodontitis in einem zugänglichen und kontrollierten Mausmodell. Daher hat dieses Protokoll Vorteile gegenüber Patientenproben oder In-vitro-Modellen. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass die Maus gut studiert wurde und dass die Methode technisch einfach in Bezug auf die Anforderungen der Anlage ist und kostengünstig ist.
Da dieses Verfahren aufgrund der geringen Abmessungen der Zähne eine Herausforderung darstellt, ist es vorteilhaft, das Verfahren zu visualisieren, um mehr über die Positionierung und Leistung der Technik zu erfahren. Nachdem Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifen bestätigt haben, legen Sie die Maus auf die dominante Handseite auf eine geschlossenzellige extrudierte Polystyrolschaumoberfläche und befestigen Sie die Pfoten mit Klebeband. Mit einem einzigen Gummiband pro Paar Schneidezähne und langen Nadeln, die an die geschlossenzellige extrudierte Polystyrolschaumoberfläche gepinnt sind, öffnen Sie den Mund.
Verwenden Sie geschlossene Zangen, die auf den Schaum geklebt sind, um die rechte Wange zurückzuziehen. Und stellen Sie den Schaum und die Maus unter ein Mikroskop und eine Lichtquelle. Ziehen Sie dann die Zunge mit einem Zahnspachtel zurück und verwenden Sie eine 27-Spur-Nadel, um 25 bis 50 Mikroliter Lokalanästhetikum in die mukokokale Falte neben dem ersten Unterkiefermolaren zu injizieren.
Gewebeschwellungen um die Injektionsstelle sollten beobachtet werden. Um den Zellstoff freizulegen, verwenden Sie jeden geeigneten Dentalmotor, der mit einem runden, hochschnellen Diamant 0,8 Millimeter Zahnbohrer mit einer Geschwindigkeit von 800 Runden pro Minute ausgestattet ist, um den okklusalen Teil des ersten rechten Unterkiefermolaren zu bohren, bis die Zellstoffhörner durch das Dentin sichtbar sind. Verwenden Sie eine K- oder H-Datei, die Nummer acht oder die Zahl 10, um das Fruchtfleisch zu durchbohren und das Dentin zu brechen, das die mesialen und distalen Zellstoffhörner bedeckt, um das Einfügen der Datei in die Hörner zu ermöglichen.
Weiter arbeiten mit den Dateien im Inneren des Zellstoffs so tief wie möglich beim Verbreitern der Öffnungen mit den Dateien, Blutungen aus dem Zellstoff wird in der Regel rund um die scharfen Kanten des Zahnes mit dem Bohrer beobachtet und entfernen Sie den Zahn aus der Aklusion, um Schmerzen während des Experiments zu reduzieren. Verwenden Sie eine Mikrobürste, um Schmutz zu reinigen. Und lassen Sie die kontralaterale linke erste Unterkiefer-Molaren als Kontrolle.
In den ersten drei Tagen nach dem Eingriff die Tiere wiegen und 0,1 Milligramm pro Kilogramm Buprenorphin intraperitoneal einmal täglich injizieren. Überwachen Sie die Tiere in den nächsten 42 Tagen zwei- bis dreimal pro Woche durch Wiegen und allgemeine Verhaltensbeurteilung. Und liefern Lebensmittelpellets mit Wasser in einer Petrischale auf dem Boden des Käfigs während der Folgenden Zeit erweicht.
Verwenden Sie am Ende des Experiments eine chirurgische Schere und Zange, um den Teil des Kiefers zu sammeln, der die drei Molaren sowohl auf der behandelten als auch auf den nicht behandelten Seiten enthält. Und verwenden Sie Zangen, um so viel des Weichgewebes wie möglich abzuschälen, so dass vor allem Knochen und Zähne auf den Proben. Spülen Sie das Gewebe kurz in PBS.
Vor der Fixierung in vier Prozent Paraformaldehyd für 24 bis 48 Stunden. Dann spülen Sie die Proben dreimal in frischePBS. Für die Mikro-Computer-Tomographie oder Micro-CT-Analyse legen Sie das geerntete Gewebe in einem Rohr mit 12 MillimeterDurchmessern mit 1,5 Milliliter PBS auf die Scannerbühne.
Mit den Proben orientiert, so dass die bukkalen oder lingualen Oberflächen des Zahnes und der Wurzel parallel zur Unterseite des Rohres liegen. Verwenden Sie einen Schwamm, um die Proben zu trennen. Und bedecken Sie die Oberseite der Röhre mit flexibler Folie.
Wählen Sie die Steuerdatei aus, und stellen Sie die Energie auf 70 Kilovolt, die Intensität auf 114 Mikroampere und die Auflösung auf eine Voxel-Größe von sechs Mikrometern ein. Klicken Sie auf Scout-View. Wenn das Bild angezeigt wird, klicken Sie auf Referenzlinie, und markieren Sie den Bereich der Beispiele zum Scannen, und klicken Sie nach jedem Beispiel auf Scan hinzufügen.
Wenn alle Beispiele markiert wurden, wechseln Sie zur Aufgabenliste, und wählen Sie "Interaktionsaufgaben starten" aus. Wählen Sie für die Konturierung der Mikro-CT-Scheiben die Scheibe aus, die die ungefähre Mitte des Zahnes darstellt, in der der koronale Zellstoff, der Radkulärzellstoff beider Kanäle und beide apikalen Foramen vorhanden sind. Klicken Sie auf das Konturfeld, und beginnend mit dem distalen Punkt der distalen Wurzelspitze markieren Sie den apikalen Rahmen koronal zum radialen paque-apikalen Bereich, durch die mesiale Grenze der mesialen Wurzelspitze, nach der distalen Grenze der mesialen Wurzel und der mesialen Grenze der distalen Wurzel, durch den Furkationsbereich.
Kopieren und fügen Sie die resultierende Kontur ein, und passen Sie die Kontur entsprechend an fünf Slices an, die auf beiden Seiten des mittleren Segments positioniert sind. Um das Gewebevolumen der für jede Probe markierten Kontur zu berechnen, wählen Sie unter Mikro-CT-Auswertung Task und klicken Sie auf 3D-Evaluierung. Klicken Sie dann im Fenster der 3D-Evaluierung auf Auswählen und wählen Sie einen Filter aus, um das Gewebevolumen zu berechnen.
Übertragen Sie am Ende der Micro-CT-Analyse das Gewebe für 10 Tage vom Scanner in ein Mikrozentrifugenrohr, das einen Milliliter EDTA enthält. Am Ende der Entkalkung die Proben für eine Stunde pro Konzentration in histologische Kassetten mit steigenden Ethanolkonzentrationen geben. Nach dem zweiten Ethanol-Eintauchen die Proben für zwei einstündiges Eintauchen in Xylol übertragen, bevor Sie die Kassetten über Nacht in 60 Grad Flüssigparaffin in einer chemischen Haube übertragen, damit das Xylol verdampfen kann.
Am nächsten Morgen legen Sie die dehydrierten Proben mit der Krone und den Wurzeln parallel zum Boden der Form in eine histologische Blockiermaschine, um die Proben in Paraffin einzubetten. Um Abschnitte zu erhalten, sichern Sie die Paraffinblockprobe auf den Mikroton-Schneidblock und trimmen Sie die Probe, bis das Gewebe von Interesse erreicht ist. Wenn ein Teil des Zahnes sichtbar ist, beginnen Sie, sechs Mikrometer dicke Abschnitte zu erhalten, den Schnittwinkel anzupassen, bis sagittale Abschnitte erhalten werden, die den koronalen und radikulären Zellstoff und das apikale Foramen enthalten.
Hier wird ein ganzer behandelter Unterkiefer gezeigt. Vergrößerung des behandelten ersten rechten Molaren, ermöglicht die Beobachtung der Exposition sowohl der mesialen und distalen Zellstoffhörner und der Eingang zu den Kanälen. Die Mikro-CT-Bildgebung ermöglicht die Visualisierung der mesialen Zellstoffexposition und der mesialen und distalen periapischen radioluzenten Bereiche der Knochenresorbtion.
Tatsächlich wird in den behandelten Zähnen eine signifikante periapikale Knochenresorbtion des Gewebevolumens gemessen, verglichen mit den Kontrollen. Die histologische Analyse zeigt, dass im behandelten Zahn der Zellstoff selbst Nekrose darstellt, die nach Der H- und E-Färbung im Vergleich zur Kontrollform des Zellstoffgewebes deutlich beobachtet werden kann. Zusätzlich, und wichtig, wird im periapischen Bereich des behandelten Zahnes eine periapikale Läsion beobachtet, die aus Immunzellen besteht, die in den Kontrollzähnen fehlt.
Es ist wichtig, die Maus während der Zellstoffbelichtung richtig zu positionieren, da eine korrekte Positionierung einen guten Zugang zum Mund des Tieres und optimale Ergebnisse ermöglicht. Nach diesem Protokoll können zusätzliche Methoden der periapischen Entzündungsanalyse wie immunhistochemische Gewebefärbung und Fax sowie eine detaillierte molekulare Analyse der Zellen durchgeführt werden. Dieses Protokoll ist nicht nur für die Zahnforschung, sondern auch für die immunologische Forschung von Bedeutung, da es ein Modell für lokal induzierte Entzündungen mit einer eingebauten internen Kontrolle bietet.
