당사의 프로토콜은 접근 가능하고 통제된 마우스 모델에서 복피 주염을 연구할 수 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 환자 샘플 또는 체외 모델보다 이점이 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 마우스가 잘 연구되었으며 시설 요구 사항 측면에서 기술적으로 간단하며 비용 효율적이라는 것입니다.
이 절차는 치아의 작은 치수로 인해 도전적이기 때문에 기술의 위치 및 성능에 대해 배울 수있는 절차를 시각화하는 것이 좋습니다. 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 폐쇄 셀 압출 폴리스티렌 폼 표면에 지배적 인 손 측에 마우스를 배치하고 테이프로 발을 고정. 한 쌍의 절개 당 단일 고무 밴드를 사용하고, 닫힌 셀 압출 폴리스티렌 폼 표면에 고정 긴 바늘, 입을 열어 소품.
폼에 테이프로 붙인 닫힌 집게를 사용하여 오른쪽 뺨을 후퇴시킵니다. 그리고 현미경과 광원 아래에 거품과 마우스를 배치합니다. 그런 다음, 치과 주걱을 사용하여 혀를 철회하고 27 게이지 바늘을 사용하여 제1 하악 골수 어금니에 인접한 점막 주름에 국소 마취제 25~50 마이크로리터를 주입한다.
주사 부위 주위의 조직 부종을 관찰해야 합니다. 펄프를 노출하려면, 펄프 뿔이 덴틴을 통해 볼 때까지 첫 번째 오른쪽 하악 형 어어의 폐색 부분을 드릴, 분당 800 라운드의 속도로 라운드, 고속 다이아몬드 0.8 밀리미터 치과 트림장착 모든 적합한 치과 모터를 사용합니다. K 또는 H 파일, 번호 8 또는 번호 10을 사용하여 펄프를 관통하고 매관및 단단 펄프 뿔을 덮는 덴틴을 부러뜨려 파일을 뿔에 삽입할 수 있도록 합니다.
파일로 개구부를 넓히면서 펄프 내부의 파일로 작업을 계속하고, 펄프에서 출혈은 일반적으로 트림으로 치아의 날카로운 가장자리를 둘러싸고 관찰되며 실험 중 통증을 줄이기 위해 치아를 제거합니다. 마이크로 브러쉬를 사용하여 이물질을 청소하십시오. 그리고 대조군 왼쪽 첫 번째 하악 어어를 제어로 둡니다.
시술 후 처음 3 일 동안, 동물을 무게와 하루에 한 번 부프레노르핀의 킬로그램 당 0.1 밀리그램을 주입. 앞으로 42일 동안 동물을 계속 모니터링하여 일주일에 2~3회 계량 및 일반 행동 평가를 실시한다. 그리고 후속 기간 동안 케이지 바닥에 페트리 접시에 물로 부드럽게 식품 펠릿을 제공합니다.
실험의 끝에서, 수술 가위와 집게를 사용하여 처리된 및 비처리 측모두에 3개의 어금니를 포함하는 턱의 부분을 수집합니다. 그리고 집게를 사용하여 가능한 한 많은 연조직을 벗겨 내어 대부분 뼈와 치아를 샘플에 남깁니다. PBS에서 조직을 간략하게 헹구는다.
24~48시간 동안 4퍼센트 의 파라포름알데히드에 고정하기 전. 그런 다음 신선한 PBS에서 샘플을 세 번 헹구습니다. 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영의 경우, 또는 마이크로 CT 분석은 스캐너 단계에서 PBS의 1.5 밀리리터를 포함하는 12 밀리미터 직경의 튜브에 수확된 조직을 배치합니다.
시료를 지향하여 치아와 뿌리의 부칼 또는 언어 표면이 튜브의 바닥에 평행하게 놓이도록 합니다. 스폰지를 사용하여 샘플을 분리하십시오. 그리고 유연한 필름으로 튜브의 상단을 덮습니다.
제어 파일을 선택하고 에너지를 70킬로볼트로 설정하고 강도를 114 마이크로 앰프로 설정하고 해상도를 6 마이크로미터 큐브 복셀 크기로 설정합니다. 스카웃 뷰를 클릭합니다. 이미지가 나타나면 참조선을 클릭하고 각 샘플 후 검사 추가를 클릭하여 스캔을 위해 샘플 영역을 표시합니다.
모든 샘플이 표시되면 작업 목록으로 이동하여 상호 작용 작업 시작을 선택합니다. Micro-CT 슬라이스의 윤곽을 위해, 코로나 펄프, 두 운하의 복사 펄프, 그리고 두 개의 정맥 포멘이 존재하는 치아의 대략적인 중간을 나타내는 슬라이스를 선택합니다. 윤곽 패널을 클릭하고, 황실 뿌리 정점의 단층 지점에서 시작하여, 심근 뿌리 정점의 매혹적인 경계를 통해, 정변 파퀴 어큐어 영역에 정황 테두리를 정관적으로 표시, 매혹적인 뿌리의 황실 테두리를 따라, 그리고 황량한 뿌리의 매혹적인 경계, 그리고 황량한 뿌리의 매혹적인 경계.
결과 윤곽을 복사하여 붙여넣은 다음 중간 슬라이스의 양쪽에 배치된 5개의 슬라이스로 윤곽을 조정합니다. 각 샘플에 대해 표시된 윤곽의 조직 볼륨을 계산하려면 Micro-CT 평가에서 작업을 선택하고 3D 평가를 클릭합니다. 그런 다음 3D 평가 창에서 필터 를 선택하고 선택하여 조직 볼륨을 계산합니다.
Micro-CT 분석의 끝에서, 10 일 동안 EDTA의 1 밀리리터를 포함하는 마이크로 원심분리기 튜브에 스캐너에서 조직을 전송합니다. 탈칼화의 끝에서, 농도 당 1 시간 동안 증가 에탄올 농도를 포함하는 조직학적 카세트에 샘플을 배치합니다. 두 번째 에탄올 침수 후, 두 개의 1 시간 침수에 대한 자일렌으로 샘플을 전송, 자일렌이 증발 할 수 있도록 하룻밤 화학 후드에 60 섭씨 액체 파라핀으로 카세트를 전송하기 전에.
다음 아침, 탈수된 샘플을 금형 의 바닥과 평행하게 향하여 파라핀에 샘플을 포함시키기 위한 조직학적 차단 기계에 배치합니다. 단면을 얻으려면 파라핀 블록 샘플을 마이크로톤 절삭 블록에 고정하고 관심 있는 조직에 도달할 때까지 샘플을 다듬습니다. 치아의 어떤 부분이 보이면 6 마이크로미터 두께의 단면을 얻기 시작하여 관상 및 복사 펄프및 압정 포먼을 포함하는 간경부 섹션까지 절단 각도를 조정합니다.
여기에, 전체 처리 하악이 표시됩니다. 처리 된 첫 번째 오른쪽 어어의 배율, 매심과 말단 펄프 뿔과 운하 입구 모두의 노출의 관찰을 할 수 있습니다. 마이크로 CT 이미징은 매혹적인 펄프 노출과 뼈 배반의 매중 및 단상 적 발적 영역의 시각화를 허용합니다.
실제로, 조직 부피의 유의한 회리골 흡수는 대조군과 비교하여 처리된 치아에서 측정된다. 조직학적 분석은 처리된 치아에서 치과 펄프 자체가 대조군 펄프 조직에 비해 H 및 E 염색 후 명확하게 관찰될 수 있는 괴사를 제시한다는 것을 나타낸다. 또한, 중요한 것은, 처리된 치아의 periapical 영역에서, 면역 세포로 구성된 심변 병변이 관찰되고, 이는 대조체 치아에 결석한다.
올바른 위치 지정으로 펄프 노출 중에 마우스를 올바르게 배치하여 동물의 입에 대한 좋은 액세스와 최적의 결과를 가능하게하는 것이 중요합니다. 면역조직화학적 조직 염색 및 팩스와 같은 periapical 염증 분석의 추가 방법은 이러한 프로토콜에 따라 수행될 수 있다. 이 프로토콜은 치과 연구뿐만 아니라 면역 학적 연구를위한 중요한 데, 그것은 내장 된 내부 제어와 국소 유도 염증에 대한 모델을 제공하기 때문에.
