Наш протокол позволяет изучать периапический пародонтит в доступной и контролируемой модели мыши. Таким образом, этот протокол имеет преимущества перед образцами пациентов или моделями in-vitro. Основные преимущества этого метода являются то, что мышь была хорошо изучена и что метод технически прост с точки зрения требований объекта и является экономически эффективным.
Поскольку эта процедура является сложной из-за небольших размеров зубов, это выгодно визуализировать процедуру, чтобы узнать о позиционировании и производительности техники. После подтверждения отсутствия реакции на щепотку ноша, поместите мышь на доминирующей стороне руки на закрытоклеточной экструдированной поверхности пены полистирола и закрепните лапы лентой. Используя одну резинку на пару резцев, и длинные иглы, приколотые к закрытоклеточной экструдированной поверхности полистирола пены, опора рот открытым.
Используйте закрытые типсы, приклеенные к пене, чтобы втянуть правую щеку. И поместите пену и мышь под микроскоп и источник света. Затем втягивайте язык с помощью зубного шпателя и используйте 27 калибровочных игл для введения от 25 до 50 микролитров местной анестезии в слизистую складку, прилегающую к первому мандибулярный молар.
Ткань опухоль вокруг места инъекции следует соблюдать. Чтобы разоблачить целлюлозу, используйте любой подходящий стоматологический двигатель, оснащенный круглым, высокоскоростным бриллиантом 0,8 миллиметра зубной бур со скоростью 800 патронов в минуту, чтобы просверлить окклюзионной части первого правого мидибулярного молара до тех пор, пока рога целлюлозы не будут видны через дентин. Используйте файл K или H, номер восемь или номер 10, чтобы пробить мякоть и сломать дентин, покрывающий мезиальные и дистальные рога целлюлозы, чтобы позволить вставить файл в рога.
Продолжить работу с файлами внутри пульпы как можно глубже при расширении отверстия с файлами, кровотечение из пульпы, как правило, наблюдается вокруг острых краев зуба с бур и удалить зуб из aclusion уменьшить боль во время эксперимента. Используйте микро-щетку для очистки любого мусора. И оставьте контралатеральный левый первый мандибулярный моляр в качестве контроля.
В течение первых трех дней после процедуры, вес животных и вводить 0,1 миллиграмма на килограмм бупренорфина интраперитонально один раз в день. Продолжайте следить за животными в течение следующих 42 дней путем взвешивания и общей поведенческой оценки два-три раза в неделю. И доставить пищевые гранулы, размягченными водой в чашке Петри на полу клетки в течение всего периода последующей деятельности.
В конце эксперимента используйте хирургические ножницы и типсы для сбора части челюсти, которая включает в себя три моляров как на обработанных, так и на необработанные стороны. И использовать типсы, чтобы снять как можно больше мягких тканей, как это возможно, оставляя в основном кости и зубы на образцах. Промыть ткани кратко в PBS.
До фиксации в четыре процента параформальдегид в течение 24 до 48 часов. Затем промыть образцы три раза в свежем PBS. Для микро-компьютерной томографии, или micro-CT анализа место собранных тканей в 12 миллиметров диаметром трубки, содержащей 1,5 миллилитров PBS на стадии сканера.
С образцами, ориентированными так, что бускальные или лингвальные поверхности зуба и корня лежали параллельно нижней части трубки. Используйте губку, чтобы отделить образцы. И покрыть верхнюю часть трубки гибкой пленкой.
Выберите файл управления и установите энергию до 70 киловольт, интенсивность до 114 микро усилителей и разрешение до шести микрометрового размера Voxel. Нажмите Скаут-Вид. Когда изображение появится, нажмите Reference-Line и отметайте область образцов для сканирования, нажав на Add Scan после каждого образца.
Когда все образцы были отмечены, перейдите в список задач и выберите задачи Start Interact. Для контурирования ломтиков Micro-CT выберите срез, представляющий приблизительную середину зуба, в котором присутствуют корональная мякоть, радикулярная мякоть обоих каналов и оба апических форм. Нажмите на контурную панель, и, начиная с дистальной точки дистальной вершины корня, отметайте апическую границу коронально в область радиальной паке, через мезиальную границу мезиальной вершины корня, следуя за дистальной границей мезиального корня и мезиальной границей дистального корня, через область меха.
Копировать и вставлять полученный контур, и настроить контур соответственно до пяти ломтиков, расположенных по обе стороны от среднего ломтика. Для расчета объема ткани контура, отмеченного для каждого образца, в соответствии с оценкой Micro-CT, выберите задачу и нажмите 3D-оценку. Затем, в окне 3D-оценки, нажмите Выберите и выберите фильтр для расчета объема ткани.
В конце анализа Micro-CT, передача тканей от сканера к микро центрифуге трубки, содержащей один миллилитр ЭДТА в течение 10 дней. В конце наклейки поместите образцы в гистологические кассеты, содержащие повышение концентрации этанола, в течение одного часа на концентрацию. После второго погружения этанола, передать образцы в ксилен в течение двух часов погружения, Перед передачей кассеты в 60 градусов по Цельсию жидкий парафин в химическом капюшоне на ночь, чтобы ксилен испаряться.
На следующее утро поместите обезвоженные образцы с короной и корнями, ориентированными параллельно нижней части формы, в гистологическую блокирующий аппарат для встраивания образцов в парафин. Чтобы получить секции, закрепите образец парафинового блока на микротонном режущей блоке и обрежьте образец до тех пор, пока ткань не будет достигнута. Когда какая-либо часть зуба видна, начните получать шесть микрометров толщиной разделов, регулировка угла резки до сагиттальных разделов, которые включают корональной и радикулярной целлюлозы и апические foramen получены.
Здесь показана целая обработанная челюсти. Увеличение обработанного первого правого молара позволяет осуществлять наблюдение как за воздействием мезиальных и дистальных рогов целлюлозы, так и за входом в каналы. Микро-КТ визуализация позволяет визуализировать мезиальной целлюлозы воздействия, а также мезиальных и дистальных периаптических радиолуния областях костного ресорбции.
Действительно, значительное периапическое ресорбирование костной ткани измеряется в обработанных зубах, по сравнению с контролем. Гистологический анализ показывает, что в обработанном зубе, зубная пульпа сама представляет собой некроз, который можно наблюдать четко после H и E окрашивания по сравнению с контролем организованной ткани целлюлозы. Кроме того, что важно, в периапической области обработанного зуба наблюдается периапическое поражение, состоящее из иммунных клеток, которое отсутствует в контрольных зубах.
Очень важно правильно расповести мышь во время воздействия целлюлозы, так как правильное позиционирование обеспечивает хороший доступ к рту животного и оптимальные результаты. Дополнительные методы периапического анализа воспаления, такие как окрашивание иммуногистохимической ткани и факс и детальный молекулярный анализ клеток, могут быть выполнены в соответствии с этим протоколом. Этот протокол имеет важное значение не только для стоматологических исследований, но и для иммунологических исследований, так как он обеспечивает модель для локального индуцированного воспаления со встроенным внутренним контролем.
