Плоскоклеточный рак пищевода, ESCC, смертельно опасен и распространен во всем мире. Трехмерные органоиды могут быть использованы для ускорения прогресса в этой области для борьбы с тяжелым бременем ESCC. Одноклеточными 3D-органоидами мышей, обработанных 4NQO, можно легко и недорого манипулировать для функциональной аннотации молекулярных изменений, сопровождающих инициацию и развитие ESCC.
Эта модель фиксирует генетическую гетерогенность мутаген-индуцированных опухолей. Таким образом, эти органоиды обеспечивают физиологически значимую платформу для тестирования новых терапевтических стратегий или выявления заметных генетических изменений, стимулирующих онкогенез. Помощь в демонстрации вскрытия животных и сбора органов будет оказывать Ясуто Томита, научный сотрудник, а демонстрацию подготовки органоида к процедуре заделки парафином будет оказывать Норихиро Мацуура, научный сотрудник моей лаборатории.
Для начала вскройте кожу усыпленных мышей, ущипнув шерсть в середине живота и хирургическими ножницами, сделайте краниокаудальный, вентральный срединный разрез от нижней части живота до подбородка. Начиная со срединного разреза, сделайте радиальные надрезы, доходящие до конечностей с обеих сторон мыши, раздуйте кожные лоскуты. Чтобы обнажить шейную трахею, с помощью рассекающих ножниц разделите слюнные железы по средней линии.
Чтобы обнажить грудную трахею, удаляют грудину. Аккуратно зажмите и приподнимите брюшину щипцами и ножницами разделите брюшину краниокаудально. и латерально вдоль грудной клетки.
Осторожно оттяните печень от каудальной поверхности диафрагмы и с помощью ножниц сделайте небольшой разрез в диафрагме в грудинной выемке, особенно на дорсальной поверхности мечевидного отростка. После того, как грудная клетка отделена от грудного содержимого, вставьте ножницы в разрез диафрагмы и рассеките краниально до шейного пояса, плотно прилегая к дорсальной поверхности грудины, чтобы избежать повреждения органов ниже. Разрежьте ножницами ребра по обе стороны от грудины и удалите грудину.
Чтобы обнажить брюшной пищевод, осторожно приподнимите живот вперед, удерживая антральный отдел щипцами. С помощью ножниц рассеките селезенку, поджелудочную железу и брыжейку из желудка и пищевода. Чтобы обнажить грудной отдел пищевода, аккуратно поднимите трахею сразу же каудально к щитовидному хрящу и рассеките пищевод тыльной стороны трахеи с помощью ножниц радужной оболочки.
Разделите трахею на щитовидном хряще ножницами радужной оболочки. Очистите трахею от остальной части пищевода, осторожно рассекая ее в каудальном направлении. Удалите легкое, сердце и тимус вместе с трахеей.
Разделите живот у привратника ножницами. Отделите пищевод от позвонка, придерживая антральный отдел щипцами и рассекая краниально. Разделите пищевод на уровне щитовидного хряща и соберите пищевод и желудок в целом.
Разделите желудок и пищевод, разделив пищевод на кардии, и рассеките любую фасцию на внешней поверхности пищевода. Чтобы зарезервировать образец для гистологии, разделите его в продольном направлении ножницами. Поместите оставшийся неповрежденный пищевод и холодный PBS на лед.
Вскройте желудок по большей кривизне и достаточно промойте PBS. Отделите предсердие и промойте холодным PBS. Чтобы собрать язык, извлеките прижатую иглу из носа и вытащите язык пинцетом.
Отрежьте язык как можно длиннее и поместите его в холодный PBS на льду. После переноса диссоциированной ткани в культуральную чашку аккуратно удалите мышечный слой из эпителия с помощью щипцов. Перенесите эпителий в микроцентрифужную пробирку, содержащую 500 микролитров 0,25% трипсина, и инкубируйте в термомиксере в течение 10 минут при 37 градусах Цельсия и 800 об/мин.
После кратковременного центрифугирования перенесите клеточную суспензию через 100-микрометровый клеточный фильтр, удерживаемый на 50-миллилитровой конической трубке с широким наконечником круговыми движениями, затем добавьте 3 миллилитра ингибитора трипсина соевых бобов, или ИППП, через ситечко, используя круговые движения для промывки, затем потрите ситечко основанием 1-миллилитрового поршня туберкулинового шприца, чтобы протолкнуть клетки. Промойте ситечко 3 миллилитрами PBS от 3 до 5 раз, протирая ситечко основанием шприца между стирками. После гранулирования клеток центрифугированием удалите надосадочную жидкость, оставив 1 миллилитр раствора в пробирке для повторного взвешивания.
После того, как гранула ресуспендирована, перенесите клеточную суспензию через 70-микрометровый сетчатый фильтр в новую коническую трубку объемом 50 миллилитров. После повторного центрифугирования пробирки ресуспендируйте гранулу в 100 микролитрах органоидной среды мыши, или MOM, и выполните автоматический подсчет клеток. Планшет 5 000 жизнеспособных клеток в 75% экстракте базальной мембраны, или BME, и MOM с общим объемом 50 микролитров на лунку.
Используя наконечник с широким отверстием объемом 200 микролитров, медленно добавьте каплю объемом 50 микролитров в центр каждой лунки, избегая контакта между наконечником и дном или стенками скважины. Дайте BME затвердеть в течение 30 минут в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа и относительной влажностью 95%. После инкубации аккуратно добавьте 500 микролитров МОМ на лунку.
Меняйте МОМ на 3 или 4 день, а затем каждые 2-3 дня после этого, пока не будет готов к прохождению. Храните размороженный BME на льду, предварительно разогрейте MOM, 0,05% трипсина и STI до 37 градусов Цельсия перед использованием. Используя наконечник микропипетки с широким отверстием, соберите органоиды в куполе BME вместе с надосадочной жидкостью и разрушите BME, пипетируя вверх и вниз.
После получения органоидной гранулы путем кратковременного центрифугирования, после ее вытеснения, ресуспендируют ее в 500 микролитрах 0,05% трипсина. Инкубируйте пробирку в термомиксере при температуре 37 градусов Цельсия и 800 об/мин в течение 10 минут. Инактивируйте трипсин 600 микролитрами ИППП.
После центрифугирования и отбрасывания надосадочной жидкости ресуспендируйте клеточную гранулу в 100 микролитрах MOM. Выполните автоматический подсчет ячеек с помощью исключения трипанового синего. Чтобы зафиксировать органоиды, аккуратно вытесните гранулу и ресуспендируйте в 300 микролитрах 4% параформальдегида на ночь при температуре 4 градуса Цельсия.
Затем подготовьте заделочную поверхность, перевернув стеллаж для микроцентрифуги и покрыв поверхность листом потолочной пленки, затем наклейте этикетку с соответствующим органоидным идентификатором. Аккуратно наложите параформальдегид, удаленный в органоидные гранулы, промытые PBS, добавив 50 микролитров агара по боковой стороне пробирки. Повторите этот шаг.
Не нарушая гранулы, перенесите гранулы в капле агарового геля на потолочную пленку на поверхности встраивания для затвердевания при 4 градусах Цельсия в течение 45 минут. С помощью щипцов осторожно перенесите каплю, содержащую затвердевшую органоидную гранулу, на маркированную кассету патологии. Нормальные органоиды пищевода и преджелудка мышей были проанализированы морфологически с помощью визуализации светлого поля и гистологического окрашивания.
Плоскоклеточный рак пищевода у мыши, получавшей 4NQO, показал ядерную атипию и резкое ороговение. Способность органоидов к самовозобновлению, оцененная путем определения скорости образования органоидов в субкультуре, показала, что скорость образования уменьшается в зависимости от времени, отражающего снижение пролиферативных базалоидных клеток в созревших органоидах. Кинетика роста органоидов проявляется по их морфологии в различные моменты времени.
Кератинизация внутреннего ядра органоидов становится заметной к 10-му дню. Пролиферативные базалоидные клетки остаются во внешнем клеточном слое даже на 14-й и 21-й день. Кривая удвоения популяции нормальных органоидов мышиного языка, полученных от мышей, не обработанных 4NQO, демонстрирует их устойчивый рост в течение нескольких проходов и длительного культивирования.
Органоиды являются платформами для высокопроизводительного скрининга для выявления новых терапевтических мишеней, редактирования на основе CRISPR для опроса конкретной функции гена или совместной культуры, чтобы определить, какие взаимодействия в микроокружении опухоли влияют на трансформацию. Этот метод позволил нам исследовать такие явления, как частичная ЕМТ и ВПЧ-инфекция, а также их взаимодействие с иммунной системой в биологии плоскоклеточного рака аэропищеварительного тракта.
