Vorhandene Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleicharbeiten, FRAP-Protokolle, sind entweder unvollständig oder übermäßig komplex. Das in diesem Video vorgestellte Protokoll ist insofern von Bedeutung, als es umfassend, praktisch und unkompliziert ist. Der Hauptvorteil dieser FRAP-Technik besteht darin, dass sie die Quantifizierung der Proteinmobilität innerhalb und zwischen subzellulären Kompartimenten in lebenden Zellen ermöglicht.
FRAP wird sowohl zu therapeutischen als auch zu diagnostischen Zwecken untersucht. Eine solche Verwendung besteht darin, die Diffusion innerhalb von Arzneimittelabgabesystemen in verschiedenen Geweben in vivo zu quantifizieren. Diese Informationen können verwendet werden, um eine Arzneimittelstruktur und -zusammensetzung zu optimieren.
Die FRAP-Mikroskopietechnik hat Einblicke in ein breites Spektrum von Bereichen geliefert, in denen das Verständnis von Diffusionsphänomenen von Interesse ist. Dazu gehören Zell- und Molekularbiologie, Entwicklungsbiologie, Neurowissenschaften, Materialwissenschaft, fortgeschrittene Biomaterialien und Arzneimittelforschung. Obwohl das beschriebene Protokoll für die Verwendung mit Säugetierzellen vorgesehen ist, können die Konzepte auf andere Systeme wie Pflanzenzellen, Hefezellen und Bakterien angewendet werden.
Eine Person, die diese Technik noch nie durchgeführt hat, kann Schwierigkeiten haben, die optimalen Bildaufnahmeparameter zu bestimmen, eine Fürstgeeignete Erfassungsregion zu schaffen und den mobilen Bruchteil und die Halbzeit der Wiederherstellung zu berechnen. Wenn Sie dieses Verfahren zum ersten Mal versuchen, sollten Sie mehrere Pilotversuche durchführen, um das Protokoll im Kontext der Ziele Ihres Experiments zu optimieren. Das Verfahren wird Maleen Cabe, ein Techniker aus meinem Labor, und David Rademacher, der Zentrale für Bildgebungs-Einrichtungsleiter, demonstrieren.
Bereiten Sie zunächst eine Platte mit YFP-p62 transfizierten RAW264.7-Makrophagen vor und behandeln Sie sie mit Lipopolysaccharid, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Als nächstes spülen Sie die behandelten Zellen einmal mit dem eiskalten Tyrodes Puffer ab. Fügen Sie dann zwei Milliliter Nocodazol-ergänzten Tyrodes Puffer auf die Platte, und lassen Sie die Platten bei vier Grad Celsius für 15 bis 20 Minuten vor FRAP-Bildgebung und Analyse inkubieren.
Lassen Sie die Platten bei vier Grad Celsius für 15 bis 20 Minuten vor FRAP-Bildgebung und Analyse inkubieren. Wählen Sie bei der Bildgebung die 514-Nanometer-Linie des Argon/2-Lasers aus, da der Fluoreszenzmarker eine Spitzenanregung von 512 Nanometern und eine Spitzenemission von 527 Nanometern hat. Klicken Sie im Fenster Lasersteuerung auf Argon/2, 458, 477, 488, 514, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Standby.
Nachdem Sie etwa drei Minuten gewartet haben, bis sich der Laser erwärmt hat, klicken Sie auf die Schaltfläche Ein. Stellen Sie dann die Laserleistung des Lasers auf 100% und drücken Sie Enter. Als nächstes stellen Sie die Übertragung der Laserlinie auf 5%Auf dem Mikroskop, drehen Sie auf die Plan-Apochromat 63x Vergrößerung 1,40 numerische Blende Ölobjektiv.
Sehen Sie sich die Probe durch das Mikroskop-Okular an und platzieren Sie eine aggresome-ähnliche induzierte Struktur in der Mitte des Sichtfeldes. Legen Sie dann in der Erfassungssoftware die Framegröße auf 512 x 512 Pixel, die Scangeschwindigkeit auf acht und die Datentiefe auf 12 Bit fest. Legen Sie auch den Scandurchschnitt auf eins, den optischen Zoom auf drei und drücken Sie die Eingabetaste.
Als nächstes, se das Loch auf 1,95 Fehlereinheiten und Detektor-Verstärkung auf 582, die knapp unter Sättigung ist. Erstellen Sie einen quadratischen Bereich von Interesse für die Bildaufnahme, der die Abmessungen 150 x 150 Pixel aufweist. Richten Sie die Zeitreihen so ein, dass die Interessenregion 35 Mal gescannt wird, einmal alle 30 Sekunden.
Stellen Sie dann die Bleichmittelkontrolle so ein, dass die Photobleichung nach dem Scan Nummer fünf erfolgt, um fünf Vorbleichenbilder der Interessenregion zu sammeln. Drücken Sie die Eingabetaste, um sie zu bestätigen. Gehen Sie anschließend zum Fenster Bleichbereiche und erstellen Sie einen kreisförmigen Bleichbereich von Interesse innerhalb des aggresome-ähnlichen induzierten Strukturbereichs, der einen Durchmesser von 10 Pixeln hat.
Legen Sie nun die Anzahl der Iterationen auf 300 fest, und drücken Sie erneut die Eingabetaste. Stellen Sie dann die Laserleitung auf 100 % Leistung ein, und geben Sie 100 in das Transmissionsprozentfeld für den Laser ein, und drücken Sie enter. Führen Sie schließlich das Bildaufnahmeprogramm aus, um FRAP-Daten von 10 aggresome-ähnlichen induzierten Strukturen in 10 Zellen mit weniger als drei Mikrometern Drift zu sammeln.
Um mit der Datenanalyse zu beginnen, übertragen Sie zunächst die AIM-lsm-Dateien zur Datenanalyse auf einen PC. Korrigieren Sie die Bilddrift, indem Sie den Stapel von Zeitreihenbildern der Erfassungsregion ausrichten oder abgleichen, indem Sie jede AIM-lsm-Datei mit einem Bildverarbeitungsprogramm öffnen. Wählen Sie dann Plugins, Registrierung, StackReg und Übersetzung aus, gefolgt von Plugins, Registrierung, StackReg und dann Starrkörper.
Als nächstes richten Sie den Bereichsmanager für Interesse ein, um die Signalintensität in der von Interesse kommenden Bleichregion zu messen. Wählen Sie dazu das ovale Werkzeug aus, zeichnen Sie dann einen Kreis im von Interesse beschaffenen Bleichbereich mit einem Durchmesser von 10 Pixeln, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Hinzufügen. Nach dem Zusatz richten Sie das Programm ein, um die Signalintensität im interessensnahen Steuerungsbereich zu messen.
Wählen Sie das Rechteckwerkzeug aus, zeichnen Sie dann ein Quadrat von 20 x 20 Pixeln im Steuerelementbereich, und klicken Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen. Schließlich wurde der Bereichsmanager für Interessensgebiete eingerichtet, um die Signalintensität im Hintergrundbereich von Interesse zu messen. Wählen Sie das Rechteckwerkzeug aus, zeichnen Sie ein Quadrat von 20 x 20 Pixeln im Hintergrundbereich, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Hinzufügen.
Nachdem Sie die im ROI Manager zu analysierenden Regionen hinzugefügt haben, benennen Sie sie entsprechend in Bleach ROI, Control ROI und Background ROI um. Messen Sie die Signalintensität in jeder Region. Um dies zu erreichen, wählen Sie Bleach ROI, Control ROI und Background ROI aus, und gehen Sie dann zu Mehr, und wählen Sie Multi Measure aus.
Fügen Sie die Ergebnisse in eine Kalkulationstabelle in Spalten mit den Bezeichnungen Bleach ROI, Control ROI und Background ROI ein. Beginnen Sie mit der Hintergrundkorrektur der Signalintensität im Bleich-ROI und dem Kontroll-ROI, indem Sie die Werte in der Spalte mit der Bezeichnung Hintergrund-ROI von den Werten in der Spalte mit der Bezeichnung Bleach ROI und der Spalte mit der Bezeichnung Control ROI subtrahieren. Beschriften Sie diese neuen Spalten Corrected Bleach ROI und Corrected Control ROI.
Als Nächstes normalisieren Sie das Signal im Bleich-ROI auf das Hintergrund-korrigierte Signal im Control ROI. Teilen Sie die Werte in der Spalte Mit der Bezeichnung Corrected Bleach ROI durch die Werte in der Spalte Mit der Bezeichnung Corrected Control ROI. Beschriften Sie diese neue Spalte, Normalized Corrected Bleach ROI.
Normalisieren Sie dann das Signal in der Spalte Normalized Corrected Bleach ROI auf den Durchschnitt der fünf Vorbleichwerte im Bleich-ROI. Teilen Sie die Werte in der Spalte mit der Bezeichnung Normalized Corrected Bleach ROI durch den Durchschnitt der fünf Vorbleichwerte im Bleich-ROI. Beschriften Sie diese neue Spalte, Normalized Corrected Prebleach Average Bleach ROI.
Öffnen Sie schließlich ein Programm für die Bildverarbeitung. Die Kurve passte zu den normalisierten und korrigierten Bleich-ROI-Daten, indem die postbleichen normalisierten korrigierten Bleich-ROI-Werte und die entsprechenden Zeitwerte kopiert wurden. Fügen Sie sie in das Fenster Kurvenanpassung ein, wählen Sie die exponentielle Erholung aus dem Dropdown-Menü Kurvenanpassung aus, und wählen Sie Anpassen aus.
Hier ist ein typisches Video der Fluoreszenzerholung nach dem Photobleichen für RAW264.7-Zellen zu sehen, die mit LPS behandelt werden. Die Fluoreszenzerholung innerhalb der aggresome-ähnlichen induzierten Strukturregion von Interesse ist langsam. Dieses Experiment verwendet Photobleaching, um den Grad der Mobilität von p62 zu untersuchen.
p62 Fluoreszenz in den aggresome-ähnlichen induzierten Strukturen, Vorbleichen und Postbleich, wird hier gezeigt. Wie in diesem Video beschrieben, kann die Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit nachverfolgt werden. Nach Hintergrundkorrektur und Normalisierung kann die p62-Fluoreszenz berechnet werden, um den mobilen Bruch als 22% der unbeweglichen Fraktion als 78% zu beschreiben und die Halbzeit der Erholung innerhalb der aggresome-ähnlichen induzierten Strukturen, als 2,14 Minuten.
Denken Sie daran, dass es besonders wichtig ist, die Erwerbsregion von Interesse richtig zu definieren, so dass sie eine ALIS von Interesse, eine Kontrollregion von Interesse und eine Hintergrundregion von Interesse umfasst. Nach diesem Verfahren können andere quantitative Fluoreszenzmikroskopie-Techniken angewendet werden, wie Fluoreszenzverlust bei Photobleichungen, FLIP und selektiver Photobleichung. Während FLIP den Grad der Kontinuität und Kommunikation zwischen subzellulären Kompartimenten misst, liefert selektive Photobleichung kinetische Informationen über den aktiven und passiven Transport von Proteinen in Organellen oder zwischen proteinreichen Bereichen.
FRAP wurde ursprünglich entwickelt, um die laterale Bewegung von Proteinen in Zellmembranen zu quantifizieren. Anschließend wurde es verwendet, um die Proteinmobilität innerhalb und zwischen einer Vielzahl von subzellulären Kompartimenten zu quantifizieren, was den Forschern den Weg ebnete, Fragen in einer Vielzahl von Bereichen zu beantworten, einschließlich Zell- und Molekularbiologie, Entwicklungsbiologie, Neurowissenschaften, Materialwissenschaft, fortgeschrittene Biomaterialien und Arzneimittelentdeckung.
