Comience iniciando el software operativo del microscopio. En la pestaña de configuración, elija el tipo de placa predefinida correcto. Presione expulsar para acceder a la platina de la placa para colocar la placa y luego presione cargar para cargar la placa en el microscopio.
A continuación, elige el objetivo de aire 20 veces con una apertura numérica de 0,4. Ajuste el collar de corrección del objetivo de aire 20x para el espesor de la placa del tipo de placa elegido. Establezca la selección de canal en Hoechst 33342 y ajuste los parámetros de imagen para el canal Hoechst.
Pruebe los ajustes elegidos seleccionando un pozo representativo dentro de la placa. En el diseño definido, seleccione todos los pozos de placa y los campos for. A continuación, elija la carpeta correspondiente en Trabajos en línea para transferir los datos al software de análisis en línea.
Se guarda la configuración del experimento. En la pestaña Ejecutar experimento, se asigna un nombre a la placa de la que se va a obtener una imagen y se inicia el proceso de creación de imágenes. Para comenzar el análisis de imágenes, primero inicie el software, elija las imágenes para el análisis y luego haga clic en la pestaña de análisis de imágenes para iniciar la segmentación de imágenes.
A continuación, haga clic en el signo más en la pestaña de la imagen de entrada para agregar un nuevo bloque de construcción. De la lista, haga clic en buscar núcleos. Elija el método de segmentación más adecuado después de inspeccionar los objetos segmentados en la imagen.
Ajuste los parámetros de detección dentro del método de segmentación. Haga clic en definir resultados y elija salida estándar como método. Haga clic en guardar análisis en la base de datos para guardar la canalización de análisis.
En la pestaña de análisis por lotes, haga clic en la canalización guardada que aparecerá en la opción de método. A continuación, seleccione los datos que se van a analizar. Inicie el análisis haciendo clic en iniciar análisis para generar el conjunto de datos para los números de celda.
El ensayo basado en células descrito se basa en una lectura reportera que refleja indirectamente los cambios en la actividad de ATG4B, lo que permite la detección tanto de inhibidores como de activadores de la actividad de ATG4B. La relación entre la actividad ATG4B de cada compuesto y su viabilidad celular se utiliza como valor de corte para la identificación de inhibidores de ATG4B. Las proporciones mayores que uno indican posibles activadores de ATG4B y las proporciones menores de uno indican posibles inhibidores de ATG4B.
