Le pinzette ottiche consentono l'intrappolamento fisico e la manipolazione di oggetti su scala micron e nanometrica in modo non invasivo utilizzando solo un raggio laser focalizzato. Questo strumento è ora applicato con successo a varie strutture biologiche, tra cui la scissione delle cellule. Il nostro laboratorio mira a studiare l'interazione diretta cellula-cellula a livello di singola cellula e a trattare ulteriormente questa disposizione laterale e strutturazione utilizzando tecniche promettenti come le pinzette ottiche.
In primo luogo, l'attuale sfida sperimentale è la mancanza del protocollo per la costruzione di sferoidi ibridi utilizzando pinzette ottiche per l'intero processo. Il secondo è la stabilizzazione su nuove riforme in sferoidi ibridi e il loro recupero per la successiva elaborazione sperimentale. In questo protocollo, dimostriamo passo dopo passo la costruzione di uno sferoide ibrido di linfoma con l'uso di pinzette ottiche.
Il vantaggio principale di questa tecnica è l'opportunità di studiare in tempo reale le interazioni dirette tra le cellule di linfoma e il microambiente tridimensionale, che è biologicamente più rilevante rispetto alla coltura cellulare tradizionale. È importante sottolineare che la tecnica qui presentata può essere facilmente adattata alle linee cellulari leucemiche e ad altre neoplasie ematopatologiche. Abbiamo in programma di utilizzare i nostri metodi per studiare i minimi cambiamenti nell'adesione di singole cellule indotte dai farmaci antitumorali.
A questo scopo intendiamo utilizzare il lignaggio tumorale di un paziente. Iniziate preparando il microstampo. Sciacquare la capsula di Petri 3D micro-stampo in acqua deionizzata e posizionarla sotto un agnello UV per 30 minuti per eseguire la sterilizzazione.
Innanzitutto, preparare una soluzione di agarosio al 2% sciogliendo la polvere di agarosio in una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% utilizzando un forno a microonde. Evitare di creare bolle durante la miscelazione o il pipettaggio dell'agarosio. Raffreddare l'agarosio a circa 70 gradi Celsius.
Successivamente, preparare gli idrogel riempiendo micro-stampi precedentemente sterilizzati con 500 microlitri di agarosio. Rimuovere eventuali bolle che potrebbero rimanere intrappolate nelle piccole caratteristiche di un microstampo mediante pipettaggio. Dopo 15 minuti, quando l'agarosio si è solidificato, rimuovere con cura i gel dai microstampi in una piastra sterile a sei pozzetti.
Prima di procedere al passaggio successivo, controllare al microscopio, verificare che il gel sia stato preparato correttamente. Aggiungere soluzione salina tampone fosfato coprendo completamente i microstampi prima di posizionare la piastra sotto una lampada UV per 30 minuti per eseguire la sterilizzazione. Prima di utilizzare i dispositivi a base di agarosio per produrre sferoidi, equilibrare il gel ricoprendoli completamente con terreno RPMI e incubare per un minimo di 15 minuti.
Coltura della linea cellulare stromale mesenchimale HS-5 in terreno di coltura completo RPMI in condizioni standard, garantendo un cambio del terreno ogni 48 ore. Quando le cellule raggiungono il 90% di confluenza, rimuovere il terreno di coltura. Lavare le cellule con soluzione fisiologica tampone fosfato e staccarle dal fondo del pallone di coltura utilizzando la tripsina.
Fermare la tripsina aggiungendo due millilitri di terreno di coltura, quindi trasferirli in una provetta conica da 15 millilitri. Centrifugare le celle a 300 volte la gravità per sette minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in un millilitro di terreno di coltura fresco.
Contare le celle nel contatore automatico utilizzando tryp e la soluzione blu. Diluirli a 200.000 cellule per millilitro. Rimuovere il terreno di coltura dai dispositivi a base di agarosio.
Seminare con cura 190 microlitri di sospensione cellulare nella camera di semina cellulare del microstampo di agarosio. Incubare le cellule per 30 minuti a 37 gradi Celsius fino a quando le cellule non si depositano sul fondo del gel. Aggiungere lentamente quattro millilitri di terreno aggiuntivo all'esterno dei gel, coprendoli completamente.
Ricordarsi di non aggiungere il terreno direttamente sul gel, ma nella piastra di coltura, evitando di danneggiare gli sferoidi appena formati. Incubare per 72 ore a 37 gradi Celsius fino a formare sferoidi uniformi. La linea cellulare ematologica cresce liberamente nei terreni di coltura in fiasche progettate per la coltura in sospensione.
Per mantenere le proprietà cellulari ottimali, si consiglia di iniziare a preparare il campione non prima di 30 minuti prima che la procedura di fatturazione acida distribuisca gli sferoidi utilizzando le pinzette ottiche. Conservare le cellule nel terreno RPMI 1640 in condizioni di coltura standard. Mantenere le colture tra 300 e 500.000 cellule per millilitro passando ogni due o tre giorni.
Per la manipolazione nelle pinzette ottiche, scegliere le celle in fase logaritmica. Raccogliere le cellule e trasferire tutta la sospensione in una provetta da 15 millilitri. Centrifugare le celle a 300 volte la gravità per sette minuti.
Rimuovere il surnatante e contare le cellule come descritto in precedenza. Diluire la sospensione per raggiungere una densità cellulare finale di 10.000 cellule per millilitro. Mantenere le celle a 37 gradi Celsius fino alla manipolazione ottica.
Il protocollo che presentiamo qui è stato sviluppato appositamente per le pinzette ottiche personalizzate. Tuttavia, i sistemi commerciali stanno diventando sempre più accessibili. Indipendentemente dal tipo di apparecchiatura disponibile nel vostro laboratorio, le fasi di base della preparazione del sistema e i principi generali di lavoro con le celle rimangono gli stessi.
Accendere la sorgente luminosa del microscopio. Indossare occhiali protettivi a prova di laser. Accendi il laser e imposta la potenza a 100 megawatt.
Prima di procedere, attendere 10 minuti, lasciando che il raggio laser si stabilizzi. Nel frattempo, avvia il software del computer. Una volta che il sistema è pronto, aggiungere 30 microlitri di acqua al centro dell'obiettivo inferiore.
Posizionare una piastra per microscopia da 35 millimetri con fondo di vetro sul tavolino del microscopio. Stabilizzare il piatto con i supporti. Sollevare l'obiettivo utilizzando la vite del microscopio micrometrico fino a quando la goccia d'acqua tocca il fondo di vetro della capsula per microcopie.
Utilizzando la vite micrometrica, regolare delicatamente il tavolino fino a quando non c'è un raggio laser nitidamente focalizzato sullo schermo. Nella finestra del software, vedrai un'immagine del campione del microscopio. Usa i marcatori visibili sullo schermo per spostare la trappola ottica nella posizione desiderata.
Aggiungere 100 microlitri di sospensione cellulare di linfoma precedentemente preparata. Lasciateli affondare sul fondo del piatto. Ci vorranno circa cinque minuti.
Utilizzando i movimenti del tavolino del microscopio, trova una cellula di linfoma fluttuante. Consenti alla trappola ottica di colpire il campione facendo clic sulla trappola che impreca . Prova a spostare la cella nella posizione desiderata.
Una cella per essere utile per la manipolazione dovrebbe essere in grado di muoversi facilmente in qualsiasi direzione. Rimuovere un singolo sferoide stromale dallo stampo di agarosio con una punta di pipetta e posizionarlo su un piatto con fondo di vetro non rivestito. Aggiungere due millilitri di terreno di coltura e incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius.
Durante questo periodo, lo sferoide si attaccherà delicatamente al vetro, impedendo il movimento durante la manipolazione. Posizionare la capsula contenente lo sferoide sul tavolino del microscopio. Aggiungere 1000 cellule di linfoma a 100 microlitri di terreno di coltura.
Lasciateli affondare sul fondo del piatto, impiegando circa cinque minuti. Seleziona una singola cellula di linfoma e intrappolala usando il raggio laser. Spostare la trappola ottica per portare la cellula a contatto con la superficie sferoidale stromale.
Inizia attaccando la cellula del linfoma allo sferoide stromale per 10 secondi. Quindi, controlla se la cellula è attaccata in modo permanente con tre tentativi ripetuti di staccare la cellula del linfoma utilizzando le pinzette ottiche. Se il contatto cellulare è interrotto, collegare nuovamente la cellula di linfoma con una superficie sferoidale utilizzando la trappola ottica, questa volta, per un periodo di tempo più lungo, circa 20 secondi.
Ripetere questo processo con le cellule di linfoma successive fino a quando l'intera superficie dello sferoide stromale è coperta da cellule di linfoma. Cambiando il piano di imaging utilizzando la vite del microscopio micrometrico, è possibile modificare la posizione della trappola ottica, il che consente il movimento degli oggetti intrappolati più profondamente nel campione. Per una migliore rappresentazione dello sferoide che si forma spontaneamente, coprire il nucleo delle cellule stromali con due o tre strati di cellule di linfoma.
Rimuovere delicatamente il terreno di coltura e lavare direttamente lo sferoide con 100 microlitri di soluto tampone fosfato. Incubare gli sferoidi ibridi con 100 microlitri di PBS contenenti una micromole di ione calcio e due micromoli di Ethidium Homodimer-1 per 20 minuti a 37 gradi Celsius. Utilizzando la microscopia a fluorescenza, osservare gli sferoidi e catturare le immagini.
Qui, abbiamo ricostruito con successo uno sferoide ibrido umano costituito da cellule stromali mesenchimali e cellule di linfoma con l'uso di pinzette ottiche. In primo luogo, gli sferoidi delle cellule stromali mesenchimali sono stati preparati in un dispositivo a micropozzetti di agarosio, che si traduce in sferoidi relativamente uniformi dopo 72 ore di incubazione. Successivamente, gli sferoidi mesenchimali sono stati utilizzati come nucleo di sferoidi ibridi di nuova costruzione con l'uso di pinzette ottiche.
Le cellule del linfoma sono state intrappolate individualmente da trappole ottiche e attaccate alla superficie dello sferoide stromale. La procedura è stata ripetuta fino a quando l'intera superficie dello sferoide stromale è stata ricoperta da cellule di linfoma. Abbiamo stabilito che le cellule RI-1 si attaccano allo sferoide stromale in 11,67 secondi con una deviazione di 3,73 secondi.
Durante il processo, sono state attaccate 65 cellule, impiegando circa un'ora e 12 minuti. La colorazione vivo-morto di sferoidi di nuova concezione ha mostrato un'elevata vitalità delle cellule utilizzate per la manipolazione, al 93%Questo articolo propone un protocollo non invasivo per la formazione di sferoidi delle cellule stromali del linfoma utilizzando pinzette ottiche. Questo metodo non solo costruisce sferoidi ibridi de novo, ma consente anche un controllo preciso sul numero di cellule attaccate e sui tempi di formazione dell'adesione, fornendo preziose informazioni per l'ingegneria tissutale.
Inoltre, questo approccio con pinzette ottiche facilita lo studio della fase iniziale della formazione di sferoidi ad alto rischio, che non può essere ottenuta utilizzando tecniche di massa standard. Ancora più importante, il nostro protocollo può essere facilmente applicato ad altri tipi di cellule, il che consentirà a questo approccio basato su pinzette ottiche di essere sempre più impiegato nel campo della coltura cellulare 3D.
