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요약

Microglia, 두뇌의 거주 면역 세포 그들의 환경의 수정에 형태학 변화 신속 하 게 응답. 이 프로토콜 2 광자 현미경을 사용 하 여 쥐의 급성 뇌 조각에서 세로토닌 또는 ATP microglial 프로세스의 매력을 공부 하는 방법을 설명 합니다.

초록

Microglial 세포는 상주 타고 난 면역 세포는 뇌의 지속적으로 그들의 긴 프로세스와 그들의 환경을 스캔 하 고, 항상성 장애 시 빠른 형태학 상 변화를 받 다. 예를 들어 레이저 병 변 몇 분에 상해의 사이트를 향해 "방향 운동" 라고도 하는 microglial 프로세스의 중심된 성장을 유도 합니다. 로컬 ATP 또는 세로토닌 (5-hydroxytryptamine [5-HT])를 제공 하 여 비슷한 효과 얻을 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 프로토콜 ATP 또는 5-젊은 성인 쥐의 급성 뇌 조각에 HT의 로컬 응용 프로그램으로 microglial 프로세스의 방향 성장을 유도 하 고 시간이 지남에 따라이 매력 multiphoton 현미경 검사 법에 의해 이미지를 설명 합니다. 무료 및 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어와 정량화의 간단한 방법을 제안 했다. 여전히 급성 뇌 조각 특징 도전은 감소 하는 세포 생리 상태에 남아 나이 제한 된 시간 이다. 이 프로토콜, 따라서, 특히 성인 쥐에서 조각에에서 몇 시간 동안 microglial 세포의 생존 능력을 최적화 겨냥 한 몇 가지 기술적인 개선 (중간, 공기-액체 인터페이스 챔버, 이중 관류와 챔버 이미징) 하이라이트.

서문

Microglial 세포 두뇌의 주민 대 식 세포는 고 두 생리 및 병 적인 조건1,2에 역할. 그들은 높게 분기 형태와는 끊임없이 확장 있고 그들의 프로세스3,4를 제거. 이 "스캔" 문제가 관련 되며 그들의 주위에의 조사에 필요한 여겨진다. Microglia의 형태소가 소성 세 가지 모드에 표시 됩니다. 첫째, 일부 화합물 빠르게 microglial 형태학을 조절: ATP5,6 또는 급성 뇌 조각 입욕 하는 매체에 NMDA5,7 microglial 파급 효과의 복잡성 증가 반면 norepinephrine 그것6감소 한다. 이러한 효과 직접 (대 한 ATP 및 norepinephrine) microglial 수용 체에 의해 중재 하거나 신경 세포에서 ATP 릴리스 (NMDA)에 대 한 필요 합니다. 둘째, 운동 성 또는 "감시", microglial 프로세스의 성장과 수축 속도 extracellular 요인8, 항상성 중단9,10또는 돌연변이9에 의해 영향을 받을 수합니다 있습니다. 10,11. 셋째, 있을 뿐만 아니라 이러한 등방성의 형태와 운동 성 microglia ATP3,5,12, 를 제공 하는 피 펫으로 향해 그들의 프로세스를 확장 하는 수 용량이 있다 13 , 14, 급성 뇌 조각 또는 vivo에서, 또는 제공 5-HT 급성 뇌 조각15문화입니다. 방향 운동 성, 라고도 하는 microglial 프로세스의 이러한 지향된 성장 처음 로컬 레이저 병 변3,4에 대 한 응답으로 설명 했다. 따라서, 순수, 그것은 상해에 대 한 응답을 관련 되거나 시 냅 스를 향해 microglial 프로세스를 타겟팅에 필요한 또는 두뇌 지역 개발15,16, 동안 또는 생리17 가지 치기를 요구 ,,1819 또는 성인 기에 병 적인 상황9,18,,1920 . 세 가지 유형의 형태학 변화 다른 세포내 메커니즘11,,1320에 의존 하 고 한 주어진된 화합물 반드시 그들 (예를 들어, NMDA에 직접 역할을 하는 모두 변조 하지 않습니다. microglia, 형태에 영향을 하지만 방향 운동 성5,7을 유도 하지 않습니다). 따라서 때 microglia에 화합물, 돌연변이 또는 한 병 리의 효과 특성화를 목표로, 그들의 형태학 소성의 세 가지 구성 요소 특성 중요 하다. 여기, 우리는, 여기의 화합물, 로컬 소스, ATP 또는 5-HT microglial 프로세스의 방향 성장 연구 하는 방법을 설명 합니다.

일부의 모델이 microglia 프로세스 매력 공부: 3D 환경6,,1819, 급성 뇌 조각6,,1315, 그리고 vivo에서 주 문화 3,13이미지입니다. Vivo에서 접근 microglia의 생리 상태를 보존 하는 최고입니다. 그러나, 깊은 지역 intravital 이미징 필요 복잡 한 수술 과정 그리고, 그러므로, 그것은 종종 피상적 대뇌 피 질의 층으로 제한. Microglia 기본 문화권을 사용 하는 많은 동물의 제한 된 수를 가진 조건 테스트를 쉬운 기술입니다. 그럼에도 불구 하 고, 비보, 에서처럼 같은 셀 형태를 얻을 수는 없습니다 그리고 셀 손실 신경와 이다 그들의 생리 적인 상호 작용. 급성 뇌 조각이 두 가지 방법 사이 타협을 대표 한다. 이 모델 transcranial 현미경 검사 법은 주로 성인에서 수행 하는 반면 어려운 도달 vivo에서, 높은 해상도 이미지 하 고 신생아 단계에서 분할 영역을 조사 하는 뇌 구조를 연구 하는 연구자를 수 있습니다. 마지막으로, 그것은 지역 마약 응용 프로그램의 효과 실시간으로 관찰 하 고 실험 동물의 제한 된 수를 사용 하 여 반복 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 급성 뇌 조각 문제는 제한 된 시간 (몇 시간) 동안 셀21,22에 2 주, 그리고 microglia 형태학의 잠재적인 변화 보다 더 오래 된 쥐에서 조각을 위해 특히 살아 남아 .

여기, 우리는 젊은이 성인 Cx3cr1의 급성 뇌 슬라이스를 준비 하는 프로토콜을 설명GFP / + 마우스를 2 개월, 몇 시간 동안 microglia 형태 및 운동 성의 보존. 우리, 그럼, ATP 또는 5-HT 같은 화합물으로 microglial 프로세스의 매력을이 분할 영역을 사용 하는 방법을 설명 합니다.

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프로토콜

모든 실험 지역 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 (다윈 위원회, 계약 # 1170와 #10921).

1. 유리 Micropipettes 화합물의 로컬 응용 프로그램에 대 한 준비

  1. 준비 붕에서 펫 전극 끌어당기는 사람와 얇은 유리 모 세관. 그들의 말단에 4-5 µ m 직경을 가진 펫을 얻기 위해 매개 변수를 조정 합니다. 그림 2D 낮은 확대율에서 대물에 한 피 펫을 보여줍니다.

2입니다. 솔루션

  1. 압력솥 사이클에 의해 청소 하는 유일한 유리를 확인 하십시오, 뒤에 헹 구는 2 x-초순, 3 x 사용 됩니다. 절대 사용 유리 paraformaldehyde 접촉 되었습니다.
  2. 2 mol·를 준비 L-1 14.7 mg CaCl2·2H2O 고 순도의 물 50 mL에 용 해 하 여 CaCl2 재고 솔루션 (초순, 저항 18.2 m ω, 증류수 또는 수돗물에 금속의 흔적 차선 슬라이스 품질 때문에 발생할 수 있습니다 프로 산화 효과)입니다.
    1. 한 달의 최대 실내 온도에이 재고 솔루션을 저장 합니다.
  3. 실험 당일, 그 조성은 110 mmol· 콜린-실제 (인공 척수) 솔루션의 1 리터를 준비 L-1 콜린 Cl, 25 mmol· L-1 포도 당, 25 mmol· L-1 NaHCO3, 7 mmol· L-1 MgCl2, 11.6 mmol· L-1 의약품, 3.1 mmol· L-1 나트륨 pyruvate, 2.5 mmol· L-1 KCl, 1.25 mmol· L-1 NaH2포4및 0.5 mmol· L-1 CaCl2, 0.5.
    1. 이 솔루션을 준비 하려면 추가, 다음 순서 대로, 졸업 1 L 플라스 크: KCl의 0.186 g, NaH2포40.195 g, ascorbic acid의 2.04 g, NaHCO3, 2.1 g 및 포도 당 4.5 g.
    2. 마지막 볼륨의 절반을 채워 초순 고 완전 한 해체까지 저 어.
    3. 0.34 g 나트륨 pyruvate와 콜린 Cl의 15.36 g를 추가 합니다.
      참고: 첫 번째 디졸브 단계 2.3.2에서에서 전체 솔루션에 그것을 추가 하기 전에 준비 하는 솔루션의 5 ~ 10 mL와 콜린 Cl에 편리 하다.
    4. 1 mol·의 7 mL을 추가 L-1 MgCl2 와 2 mol·의 250 µ L L-1 CaCl2 (준비 단계 2.2에서에서) 솔루션.
    5. 초순에 졸업된 플라스 크 1 L 채우십시오.
    6. 증기 압력 osmometer와는 osmolarity 300과 310 m ω 사이 인지 확인 합니다. 그렇지 않은 경우에 포도 당으로 조정.
    7. Carbogenation (즉,: "carbogen"와 버블링, 95% O2/5% CO2의 혼합) 후 pH를 확인 하 고, 필요에 따라 7.3-7.4 10 M NaOH로 조정.
    8. 저장용 유리 병에 솔루션을 전송 합니다. 사용 (3.1 단계)까지 냉장고에 있는 병을 유지.
      참고: 실험 당일 신선한 솔루션을 확인 하는 것이 좋습니다. 그러나, 필요한 경우, 콜린-실제 저장 될 수 4 ° c.에 2 일에
  4. 실험 당일, 그 조성은 124 mmol·는 실제 솔루션의 1 리터를 준비 L-1 NaCl, 26.2 mmol· L-1 NaHCO3, 25 mmol· L-1 포도 당, 2.5 mmol· L-1 KCl, 2 mmol· L-1 CaCl2, 1 mmol· L-1 MgCl2및 1.25 mmol· L-1 NaH2포4.
    1. 이 솔루션을 준비 하려면 추가, 다음 순서 대로, 졸업된 플라스 크: NaH2포40.150 g, KCl의 0.186 g, NaHCO3의 2.2 g, 포도 당의 4.5 g, NaCl의 7.3 g. 초순 물 1 L의 볼륨에는 솔루션을가지고 고 저 어 접시에 적극적으로 그것을 저 어.
    2. 1 mol·의 1 mL을 추가 L-1 MgCl2 와 2 mol·의 1 mL L-1 CaCl2 솔루션 및 스토리지에 대 한 유리 병에 전송 실제 솔루션.
    3. osmolarity 300-310 mΩ· 인지 확인 L-1 경우, 포도 당으로 그것을 조정 하는 고.
    4. Carbogenation 후 pH를 확인 (즉, "carbogen"와 버블링) 7.3-7.4 10 M NaOH와 함께 필요한 경우, 그것을 조정 하 고.
    5. 저장용 유리 병에 솔루션을 전송 합니다. 사용 (3.1 단계)까지 냉장고에 있는 병을 유지.
      참고: 실험 당일 신선한 솔루션을 확인 하는 것이 좋습니다. 그러나, 4 ° c.에 더 이상 1 주일 동안 저장 될 수 있다 최종 농도 x 10에 NaCl, NaHCO3, KCl, 및 NaH2PO4 를 포함 하는 재고 솔루션 x 10을 준비 하는 대신 초순 물으로 10 배 재고 솔루션을 희석 하 고 포도 당, CaCl2, MgCl2를 추가 하 여 실험의 날짜에 마지막 실제를 확인 합니다.
  5. 실험 당일 마약 솔루션을 준비 합니다. 실제 솔루션을 사용 하 여 최종 농도, 여기, 500 µmol·에 그들을 L-1 ATP와 5 µmol· 5-HT에 대 한 L-1
    참고: ATP, 재고 솔루션 준비 하실 수 있습니다 (예를 들어, 50 m m 물에서 ATP),-20 ° C에 aliquoted 형태로 저장 하 고 실제 실험 당일 최종 농도에 희석. 반면, 5-HT (세로토닌-HCl) 솔루션 1 mg·mL-1 물에서 실험의 하루에 분말에서 준비, 5-HT 산화를 피하기 위해 4 ° C에서 보관이 고 실험의 때에 실제에 희석 있습니다.

3입니다. 급성 뇌 조각의 준비

  1. 절 개 면의 준비
    1. 얼음 심장 관류, 급속 한 뇌의 냉각 및 자르는 데에 80 mL 비이 커에 얼음 처럼 차가운 콜린-실제의 70 mL를 준비 합니다. 150 mL 200 ml 접시, 32 ° c.에 유지 온수 물 욕조에 배치를 crystallizing 콜린-실제의 준비 슬라이스를 유지 하는 장소 crystallizing 접시에 나일론 메쉬 스 트레이너. 이 조각 슬라이스 후 10 분 동안 복구할 수 있도록 사용 됩니다.
    2. (3.2 단원), 해 부를 시작 하기 전에 적어도 30 분 시작 이러한 두 가지 솔루션 (얼음에 콜린-실제의 70 mL)와 콜린-실제 32 ° C에서의 150 mL carbogen와 버블링. 전체 절차 동안 상수 carbogenation를 유지 합니다.
    3. 그들의 사용까지 분할 영역을 유지 하는 데 사용 됩니다 인터페이스 챔버 장치 (그림 1C)을 준비 합니다.
      1. 봉인 된 음식 상자에 (10 x 10 cm 또는 10 cm 직경, 높이 8cm)는 자력에 설치 장소 바 접시 crystallizing 200 mL 자석.
      2. Crystallizing 접시에 실제의 200 mL를 추가 하 고 3D 인쇄 인터페이스 슬라이스 홀더 (인터페이스 슬라이스 홀더는 서로 그림 1A, B뻗어 폴 리아 미드 메쉬 부분의 두 완벽 하 게 피팅, 구성) 위에 놓습니다.
      3. 인터페이스 조각 소유자의 메쉬를 포함 하는 솔루션의 얇은 필름만 계속 crystallizing 접시에서 초과 볼륨을 제거 합니다. 이것은 나중 좋은 변죽 슬라이스를 둘러싼 솔루션의 (하지만) 그들을 취재 하지 않고 만듭니다.
      4. 실제의 몇 밀리미터 음식 상자 아래쪽에 넣고 carbogen와 버블링 시작 (처음 사용 시 확인 작은 구멍 봉인된 음식 상자 벽 튜브 박스를 입력할 수 있는지 확인).
      5. 상수 carbogenation를 유지 하면서 봉인 된 상자를 닫습니다. 습도 95% O2/5% CO2 풍부한 환경을 있는 조각 콜린-실제에 그들의 회복 후 전송 되며 그들은 군데는 전에 유지 만들어집니다. 이 장치는 라 함 "인터페이스 챔버" (그림 1C).
  2. 뇌 해 부 및 슬라이스
    1. Anesthetize 50 mg·mL-1 pentobarbital (0.15 mL/20 g 마우스 몸 무게)의 복 주사와 마우스, 그것을 고정, 마음, 노출 및 수행의 얼음 처럼 차가운, 10 mL와 함께 심장 관류 carbogenated, 콜린-실제 (단계를 참조 하십시오 3.1.1), 연동 펌프. 좋은 관류의 지표로 서 간 증상을 관찰 합니다. 관류 5 분 미만 지속 한다.
    2. 목을 벨 마우스와 두개골을 폭로 하는 피부를 잘라. 큰가 위, 큰 구멍 및 1 개의 긴 화살 컷에서 두 횡단 상처를 적용 하 고 두개골 플레이트를 제거 미세 집게를 사용 하 여.
    3. 신속 하 고 부드럽게 (1 분 미만)에 두뇌를 추출 하 고 그것을 진정 위하여는 나머지 (~ 60 mL) 얼음 처럼 차가운 콜린-실제 (여전히 아래 상수 carbogenation)를 포함 하는 80 mL 비 커에 1 분 동안 그것을 배치.
    4. 전송 이전 실제와 젖은 필터 종이에 두뇌.
    5. 두뇌의 뇌 영역 및 슬 라이 싱의 기본 각도 잘라. 예를 들어 시상 또는 코로나 조각에 해 마 이미지를 잘라 메스 칼 날 소 뇌 그리고, 두뇌의 rostral와 꼬리 말단에서 m m 2에 대 한.
      참고: 너무 rostral 또는 꼬리 너무 뇌 부분을 제거 하는 것이 중요 하다 때문에 관심의 영역에 도달 하기 전에 트림을 작은 지역 빨리 자르는. 단계에 대 한 조각화 (3.2.7) 미만 20 분의 총 시간 것이 좋습니다.
    6. 코로나 슬라이스 및 진동 슬라이서의 커팅 블록에 붙어 10 cm 배양 접시에 두뇌의 꼬리 얼굴 (cyanoacrylate 접착제)와 접착제 놓고 큰 약 실에서 진동 슬라이서의 저수지 상공에 위치 얼음으로 가득합니다. 그런 다음 페 트리 접시 채울 모든는 나머지 얼음 콜린-실제.
    7. 95% O2/5% CO2 일정 유지 하면서 300 µ m 두께 코로나 조각 잘라 차가운 콜린-실제의 버블링 (속도: 0.08 mm·s-1, 블레이드 진동: 60 Hz, 진동 진폭: 1mm).
    8. 넓은 입 (지름 4 mm) 일회용와 뇌 조각 플라스틱 수집 블레이드, 독성 구성 요소 조각 주변에 의해 발표의 축적을 피하기 위하여의 모든 단일 패스 후 하나 하나. 복구에 대 한 약 10 분 동안 32 ° C에서 콜린 실제에 각 분할 영역을 전송 하는 동안 공기 거품을 피하기 위해 주의.
    9. 전송 피 펫과 함께 자리를 렌즈 청소의 조각에는 조각 종이 콜린-실제의 한 방울으로 장식. 콜린-실제의 초과 발음 하 고, 주걱, 조각, 실 온에서 carbogenated 실제를 포함 하는 인터페이스 챔버의 메쉬에 렌즈 청소 조직에 배치할 (3.1.3.5 참조). 적어도 30 분 동안이 환경에서 복구 하는 분할 하자.
      참고: 이 후, 슬라이스 준비 하며 2 개월 오래 된 성인에서 뇌 추출 후 microglia 영에서 뇌 추출 후 최대 6 h에 대 한 이미징 (미만 1 개월) 마우스 및 최대 4 h 사용할 수 있습니다.

4. 2-광자 현미경

  1. 매개 변수 설정
    1. Multiphoton 시스템 (하이브리드 탐지기, 레이저 스캐너, 전기 광학 변조기, 현미경)에 전환.
    2. 920에서 레이저 조정 nm, 레이저 모드 고정 고 5%-15%와 10%에서 이득에 전원을 설정 확인. 이 목표 아래 3-5 mW의 파워에 해당합니다. Nondescanned 감지기는 종사 하는 적절 한 방출 및 여기 필터 설치 확인 합니다.
    3. 이미징 소프트웨어의 매개 변수는 다음 값으로 설정: 프레임 크기, 295.07 µ m; x 295.07의 지역에 해당 하는 1024 x 1024 픽셀에 대 한 확대, 2에 대 한. 신호가 아주 시끄러운 경우에, 2의 선 평균을 적용 합니다. 픽셀 역학에 대 한 이미징 소프트웨어 12 비트 이상으로 설정 합니다.
      참고: 높은 비트 값으로 이미지 낮은 비트 값으로 이미지 보다 형광 강도에 작은 차이 구별 하는 연구자 수: 8 비트 이미지에 회색 값 256 회색 및 12 비트에서 16 회색 값의 변화에 대응할 것입니다 하나의 변화 나 값 n 16 비트 이미지를. 따라서, 더 높은 비트 이미지는 정량 분석에 더 적합 하지만 그들의 크기가 증가 비트 깊이, 저장 용량, 그리고 컴퓨팅 파워 제한 될 수 있습니다.
    4. 스캔 모드 XYZT Z 간격 범위 2 µ m와 T-2 분의 간격을 선택 합니다.
      참고: X, y 및 z 해상도 나이 키스 트 샘플링 정리에 의해 결정 됩니다. Microglia 프로세스를 해결 하기 위해 최적의 것입니다 0.8 주위 Z 스텝 크기 (직경의 < 1 µ m), multiphoton 현미경의 광학 해상도 제한 하지만 (920에서 0.95 나 목적으로 nm, 축 분해능은 1 µ m 주위). 그 위에 물리적 장벽, 라이브 이미징 실험, 감도 또는 신호 대 잡음 비율, 해상도, 속도, 그리고 총 관찰 시간 문제에서 했다. 이러한 모든 매개이 변수, 2 µ m (수많은 연구3,,1114)로, 1024 x 1024 픽셀의 이미지 크기와 유압 감지기 (그것에 결합 된 공명 스캐너를 사용 하 여 고속 수집의 z 단계를 고려 15 정도 소요 50 z-계획을 취득 하는 s) 여기에 선정 됐다. 취득의 주파수 1 XYZT 시리즈 마다 2 분 이며 총 기간은 30 분. 설정 하지 않으면 빠른 또는 충분히 민감한, 그것 (512 x 512) 아래로 측면 해상도 또는 z 조각의 수를 줄이기 위해 가능 하다 (강한 형광을 전시 하는 z 깊이에서 독점적으로 이미징 하 여 [즉, 아니라 깊은 z-조각 어디 형광은 희미 한]), 또는 스캐너의 속도 감소. 축 해상도 또한 3 µ m, 최대 z 단계 증가 의해 감소 될 수 있습니다 하지만이 정량화에 영향을 미칠 수, 비교할 모든 실험 같은 z-단계와 수행 되어야 한다.
      참고: 그것은 CX3CR1creER YFP 쥐18, microglia만, 유전 삭제를 유도 하 고 어떤 microglia constitutively 노란 형광 성 단백질 (YFP) 표현 하는 데 사용 하는 마우스 선 조각에 비슷한 실험을 수행할 수 있습니다. 그러나, YFP 식 수준은 매우 낮은 CX3CR1에 녹색 형광 단백질 (GFP)에 비해GFP / + 쥐; 따라서, 이미징 가능 하지만 도전 하며 인수 매개 변수의 최적화. 다음과 같이 그들을 조정 하는 것이 좋습니다.
    5. 970에서 레이저 조정 nm (920 보다 YFP 여기에 맞게 더 나은 nm), 50%, 그리고 50%, 5-6 mW의 목표 아래 레이저 파워에 해당에서 이득에 전원.
    6. 신호 대 잡음 비율을 개선 하기 위해 4 (또는 이상)의 선 평균을 설정 합니다.
  2. 위치는 슬라이스 및 유리 제 micropipette 및 화합물의 로컬 응용 프로그램의
    1. 녹음 실, 녹음을 시작 하기 전에 30 분을 연동 펌프를 연결 합니다. 초순의 50 mL와 함께 전체 관류 시스템을 청소 후 실제 (50 mL) 상수 carbogenation 아래 유리 비 커에 포함 된 녹음 실의 관류를 시작 합니다. 실험을 통해 순환 실제 인라인 microheater 또는 Peltier 히터와 32 ° C를 유지.
      참고: 위쪽 및 아래쪽 관류와 특정 관류 챔버는 조각의 양쪽에 산소를 최적화 하기 위해 설계 되었습니다. 관류 챔버 두 완벽 하 게 피팅 부품, 폴 리아 미드 메쉬 (그림 2A, B)을 서로 뻗어 구성 됩니다. 챔버, 어디 조각 유리 coverslip에 직접 누워 있다의 다른 종류에 비해이 챔버 조각의 하단 부분에 있는 신경 죽음을 감소, 생존, 향상과 팽창에 의해 유도 된 조각 움직임을 감소.
    2. 넓은 입 일회용 전송 피 펫과 뇌 조각 렌즈 종이 제거, 싱크 (증거로 아무 공기 방울이 연결 되어), 및 녹음 (관류) 약 실에 그것을 전송 실제 비 커에 이미지를 전송 합니다.
    3. 관류 흐름 때문 슬라이스 움직임을 최소화 하기 위해 조각에 조각 홀더 (플래티넘의 병렬 나일론 스레드 합류 하는 두 가지로 만든 헤어핀)를 배치 합니다.
    4. 밝은 분야 조명을 사용 하 여 관심 뇌 영역을 대상 (노출 시간: 50 ~ 80 ms) (5 X 또는 10 X) 낮은 배율 목표를 사용 하 여. 높은 배율 (25 x 0.35 x 렌즈) 물 침수 목적을 전환 하 고 위치를 조정 합니다.
      참고: 그들은 빛을 차단 하 고 로컬로 슬라이스를 변형 수 조각 보유자의 나일론 스레드 가까운 이미지 필드를 피하십시오. 관심 영역 평면 있는지 확인 합니다. 필요한 경우 분할 위치를 조정 하려면 분할 영역 홀더 또는 슬라이스 홀더를 제거 합니다.
    5. 필드에 이미지를 형광 microglial 세포를 사용 하는 형광 조명 (노출 시간: 250-500 ms).
      참고: 이 단계 연구자를 관심과 그들의 형광 강도의 지역에 있는 세포의 존재를 확인 하 고 세포질 파편의 양을 제어할 수 있습니다.
    6. 백필 실제의 10 µ L 피펫으로 ATP, 함께 5-HT, 또는 그것의 최종 농도에 대 한 관심의 마약. 포인트 팁 아래와 부드럽게 흔들어 약물 가득 피 펫 팁에 갇혀 모든 기포를 제거 하.
      참고: 주입을 솔루션 폼 거품 경향이, 내부 필 라 멘 트와 함께 붕 규 산 펫을 사용 하십시오. 피펫으로에서 ATP의 누설도 주사 하기 전에 microglial 프로세스를 유치 할 수 있습니다 (이 경우, 그것은 볼 수 분석 단계에서). 이 ATP 농도와 적당 한 있어야 지만 사용 (500 µmol· L-1), 문제 라면, 고려는 micropipette ATP (또는 다른 화합물)를 추가 하기 전에 실제의 2 mL와 함께 prefilling 단계 4.2.6 솔루션.
    7. 5 mL 위치에 위치 하는 플런저와 함께 투명 한 튜브 5 mL 주사기를 연결 하는 피 펫 홀더에서 채워진된 피 펫을 탑재 합니다. 자체 피 펫 홀더 3 축 micromanipulator에 거치 된다.
    8. 필드 밝은 조명 아래는 micromanipulator 피펫으로 필드의 중앙에 위치를 사용 합니다. 재현성 및 최적의 중심, 표시 및 눈금자를 사용 하 여 이미지에.
    9. 낮은 조각으로 부드럽게 피 펫, 제어 하 고 가볍게 피 펫 팁까지 동시에 목표를 조정 접촉 조각의 표면. 그것은 조각을 만져 볼 수는 피 펫의 강하를 막을 수 80-100 µ m의 조각의 표면 침투 피 펫 팁 ( 그림 3B참조).
    10. 레이저 튜닝 (위의 매개 변수 참조) 현미경 multiphoton 모드로 전환. 모든 광원 (예를 들어, 컴퓨터 화면)에서 챔버 상영은 다는 것을 확인 하십시오. Nondescanned 감지기에 전환 하 고 이득을 설정 합니다. 색으로 구분 된 상한 룩 업 테이블 (LUT)를 사용 하 여 이미지의 픽셀을 포화를 피하기 위해.
    11. 이미지 수를 슬라이스의 두께 결정 (즉, 상위 및 하위 z-위치 형광은 [총에서 220와 290 µ m] 사이 보통 감지).
      참고: 조각의 표면에 조각의 내부에 비해 특이 한 형태와 종종 microglia 가능성이 프로세스의 증가 밀도가 있다. 이 축적 시간 (즉,., 이미지 수를 첫 번째 뇌 조각에 보다 마지막에 눈에 보이는) 더 눈에 띄는 것입니다. 따라서, 처음 ~ 30 µ m에서 z-비행기 분석을 위해 사용 하지 않아야 하 고 인수에도 건너뛸 수 있습니다.
    12. 30 분 (또는 원하는 경우 더)의 전체 기간 동안 기록 시작 하 고 5 분 기준 후 로컬로 적용 (방해는 이미징) 없이 테스트할 화합물. 이렇게 하려면 1 mL 위치에 5 mL에서 micropipette에 연결 하는 주사기의 플런저를 눌러 천천히 (약 5에서 s). 플런저를 눌러 때 즉시 느낄 수 있어야 합니다. 그렇지 않은 경우에 팁 깨진 수 있습니다.
      참고: 훈련 된 실험에 대 한이 방법으로 주사 재현할 수, 있지만 또는 주사기의 수동 조작에 피펫으로 수 연결할 배달 볼륨의 더 나은 제어를 허용 하는 자동된 압력 배출 시스템. 주사는 주사의 사이트에서 조각의 물리적 왜곡을 만듭니다. 이 왜곡 표시 됩니다 첫 번째 두 개 또는 세에서 귀납적 주입 후 이미지 하지만 4 번째 이미지 (즉, 주입 후 8 분)에 표시 해서는 안됩니다. 그것은 지속 되 면, 피 펫 준비에 대 한 매개 변수를 변경 하는 것이 좋습니다.
    13. 수집 (30 분)의 끝에는 micropipette 삭제 하 고 분할을 제거 합니다. 원하는 경우 조각을 더 immunolabeling에 대 한 수정. 예를 들어 스냅숏 메서드는 고정에 대 한 최적화 하 고23조각 두께의 얼룩.
    14. 새 분할 영역을 이미지, 2D 영화 (섹션 5.1) 해당 microglia를 확인 하기 위해 확인을 시작 하기 전에 정상적인 형태 하 고는 이동 하 고, 따라서, 슬라이스는 건강 한.

5. Microglial 프로세스의 매력 분석

  1. 2D 투영 및 드리프트 보정
    1. 파일 (. LIF) 피지24.
    2. 필요한 경우만 z-비행기 관심의와 substack (이미지/스택/도구/확인 Substack)을 확인 합니다. 예를 들어 z-비행기 획득 되지만 분석에 사용할 수 없습니다 하는 경우에 해당 하는 조각의 표면 제외 (단계 4.2.11 후 메모 참조)와 아무 형광과 깊은 z 비행기. 최종 스택 90-110 z-조각 (180-220 µ m)에 일반적으로 포함 되어 있습니다.
    3. Z 프로젝트 기능 실행 (이미지/스택/Z 프로젝트") 고 z 스택의 각 시간 지점에서 인수 계획을 최대 강도 프로젝션 유형을 선택 합니다.
    4. MultiStackReg 플러그인 (플러그인/등록/MultiStackReg), 실행 선택 작업 1: 정렬 및 변환: 강 체 인수 하는 동안 발생 한 수 있습니다 약간의 드리프트를 해결 하기 위해. 새 파일 (.tiff)로이 2D 영화를 저장 합니다.
  2. 데이터 처리
    1. 얼음25를 가진이 새 파일을 엽니다.
    2. 35 µ m 직경, 사출 사이트 (특히 피펫으로 주입의 때에 만든 왜곡의 그림자에 의해 식별 됨)에 중심에 관심 (ROI)의 원형 R1 영역을 그립니다.
    3. 투자 수익 강도 진화 플러그인을 사용 하 고 r 1에서 시간이 지남에 평균 강도 측정.
    4. 결과를 저장 한. XLS 파일입니다.
  3. 정량화 및 결과의 표현
    1. 시간이 지남에 따라 microglial 응답을 계량 하려면 각 시간 지점에서 결정
      figure-protocol-13198
      Here,'R1(0) 주사 하기 전에 R1(t) 값의 평균입니다. 그런 다음, 결과 microglial 응답의 운동으로 대표 될 수 있다 또는 특정 시간에 포인트 ( 그림 7참조).

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결과

이 프로토콜 유도, 관찰, 및 로컬로 적용된 화합물 향해 microglial 프로세스의 중심된 성장 계량 하는 방법에 설명 합니다, 예를 들어 ATP 또는 5-HT, 급성 뇌에 영 또는 성인에서 조각 (적어도 까지의 2 개월) 쥐. 몇 시간 동안 건강 한 상태에서 성인 동물에서 뇌 조각을 유지에 기여 하는 요인 들 중 프로토콜의 2 단계에서 세포 생존을 최적화 하도록 설계 된 두 개의 도구를 사용...

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토론

유지, 달리에서 해리 또는 organotypic 슬라이스 문화, 구조적 무결성 제한 된 네트워크 조정, 급성 뇌 조각 허용 microglia 그들의 생리 적인 환경에서 공부 하는 연구자. 그러나, 주요 한계 중 하나는 조각화 절차 빠르게 특히 성인 두뇌에서에서 뉴런의 생존 능력을 손상 시킬 수 있는 부상 만듭니다 사실 이다. Microglia 특히 세포 손상에 반응으로, 그것은 가능한 그들의 생리 적인 상태에 가까운 microglia?...

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공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

우리는 세포와 조직의 이미징 시설 인 뒤 Fer à 무 랑, 어디 모든 이미지 수집 및 분석 수행 되었습니다 감사 합니다. 이 작품 일부는 센터 국립 드 라 검색 사이언스 인 국립 드 라 건강에 의해 지원 되었습니다 동부 표준시 드 라 공 들인 Médicale, 소 르 본 대학교 과학 그리고 소 르 본 Universités-피에르에서 교부 금에 의해 외 마리 퀴리 대학 ( Emergence-UPMC 프로그램 2011/2014)는 Fondation 부 la Recherche 쉬르 르 Cerveau, Fondation 드 프랑스에서 Fondation 라 검색 Médicale "Equipe FRM DEQ2014039529", 연구 (직원 회 부 라 Recherche 프랑스 정부, ANR-17-CE16-0008 및 Investissements d'Avenir 프로그램 "바이오 싸이 Labex" ANR-11-IDEX-0004-02) 및 전산 신경 과학 프로그램, 연구를 위한 국립 과학 재단/프랑스 국가 기관에서에서 공동 연구 (번호: 1515686). 모든 저자는 연구 제휴는 파리 학교 신경 (ENP) 바이오 싸이 Labex의 구성원을 그룹화 합니다. F.E. 소 르 본 대학교, Collège 박사, F-75005 파리, 프랑스, 제휴 박사 학생 이며 바이오 싸이 Labex에 의해 자금이 다. V.M.은 박사 후 연구원 전산 신경 과학 프로그램, 국립 과학 재단/프랑스 국립 기관 연구에 대 한 공동 연구에 의해 투자 (번호: 1515686). 저자는 프로젝트의 개시에 참가 마르타 Kolodziejczak 감사 합니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
for pipettes preparation
Clark Borosilicate Thin Wall CapillariesHarvard Apparatus30-0065Borosilicate Thin Wall without Filament, 1.5 mm OD, 1.17 mm ID, 75 mm L , Pkg. of 225
DMZ Universal PullerZeitz Instrumente
NameCompanyCatalog NumberComments
for solutions
Calcium Chloride dihydrate (CaCl2)SigmaC5080
Choline ChlorideSigmaC7527
D-(+)-GlucoseSigmaG8270
L-Ascorbic acidSigmaA5960
Magnesium Chloride solution 1 M (MgCl2)Sigma63020
Potassium chloride SigmaUltra >99.0% (KCl)SigmaP9333
Sodium bicarbonate (NaHCO3)SigmaS5761
Sodium Chloride (NaCl)SigmaS5886
Sodium phosphate monobasicSigmaS5011
Sodium pyruvateSigmaP2256
Ultrapure waterMilliQfor all the solutions
NameCompanyCatalog NumberComments
for slice preparation
2x 200 mL crystalizing dishes
80 mL Pyrex beaker
Antlia-3C Digital Peristaltic pumpDD Biolab178961For mice perfusion and 2-photon chamber perfusion (aCSF)
Carbogen 5% CO2/95% O2Air Liquide France Industrie
DolethalVetoquinolDolethal 50 mg/mL
Filter papers (Whatman)SigmaWHA1001042Whatman qualitative filter paper, Grade 1 (Pore size: 11µM)
Fine Scissors - SharpFine Science Tools14060-60
Food box 10 cm diameter, 8 cm Height
glue (ethyl cyanoacrylate)Loctitesuper glue 3 power flex
Hippocampal Tool (spatula)Fine Science Tools10099-15The largest extremity has to be angled at 90°
Ice
Iris Forceps (curved)MoriaMC31
Lens cleaning tissueTHOR LABS
Nylon mesh strainerdiameter 7 cm
Razor bladesElectron Microscopy Sciences72000For the slicer
scalpel blade
Slice interface holderhome-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material
Surgical Scissors - SharpFine Science Tools14002-14
Vibrating slicerThermo Scientific720-2709Model: HM 650V (Vibrating blade microtome)
Water bathSet at 32 °C (first recovery step)
NameCompanyCatalog NumberComments
for slice imaging
× 25 0.95 NA water-immersion objectiveLeica Microsystems (Germany)HCX Irapo
2-photon MP5 upright microscope with resonant scanners (8 kHz) and two HyD Hybrid detectorsLeica Microsystems (Germany)
Antlia-3C Digital Peristaltic pumpDD Biolab178961For 2-photon chamber perfusion with aCSF
Carbogen 5% CO2/95% O2Air Liquide France IndustrieI1501L50R2A001
Chameleon Ultra2 Ti:sapphire laserCoherent (Germany)
disposable transfer pipettes , wide mouthThermoFischer scientificfor example : 232-115.8 mL with fin tip, but we cut it (approx 7 cm) to have a 4 mm diameter mouth
emission filter SP680Leica Microsystems (Germany)
fluorescent cube containing a 525/50 emission filter and a 560 dichroic filter (for fluorescence collection)Leica Microsystems (Germany)
glass beaker with 50 mL of ACSF to maintain constant perfusion of the slice
Heating systemWarner Instrument CorporationAutomatic Heater Controller TC-324Bto maintain perfusion solution at 32 °C
perfusion chamberhome-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material
slice holder ("harp")home made : hairpin made of platinum with the two branches joined by parallel nylon threads
NameCompanyCatalog NumberComments
for slice stimulation
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)SigmaA-26209to be prepared ex-temporaneously : 1 mg/mL (3 mM) stock solution prepared the day of the experiment, kept at 4 °C (a few hours) and diluted just before use
Fluorescein (optional)SigmaF-6377use at 1 µM final
MicromanipulatorLuigs and NeumannSM7connected to the micropipette holde
Micropipette holdersame as for eletrophysiology
Serotonin hydrochlorideSigmaH-9523aliquots of 50mM stock solution in H20 kept at -20 °C. 500 µM solution prepared the day of the experiment.
Syringe 5 mL (without needle)Terumo medical productsSS+05S1
Transparent tubingFischer Scientific11750105Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon™ E-3603 Non-DEHP Tubing
NameCompanyCatalog NumberComments
for image analysis
Fijihttps://fiji.scSchindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038
IcyInstitut Pasteurhttp://icy.bioimageanalysis.orgde Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012)
NameCompanyCatalog NumberComments
mice
CX3CR1-GFP miceJung et al, 2000male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background.
CX3CR1creER-YFP miceParkhurst et al 2013male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background.

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