Estudo Comparativo de Matrizes de Membrana Basal para Manutenção de Células-Tronco Humanas e Geração de Organoides Intestinais

Summary

Os organoides tornaram-se ferramentas valiosas para a modelagem de doenças. A matriz extracelular (MEC) orienta o destino da célula durante a geração de organoides, e o uso de um sistema que se assemelha ao tecido nativo pode melhorar a precisão do modelo. Este estudo compara a geração de organoides intestinais humanos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas em ECM derivada de animais e hidrogéis livres de xeno.

Abstract

A matriz extracelular (MEC) desempenha um papel crítico no comportamento e desenvolvimento celular. Organoides gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) estão no centro das atenções de muitas áreas de pesquisa. No entanto, a falta de pistas fisiológicas em materiais clássicos de cultura de células dificulta a diferenciação eficiente de iPSC. A incorporação da ECM disponível comercialmente na cultura de células-tronco fornece pistas físicas e químicas benéficas para a manutenção celular. Os produtos de membrana basal comercialmente disponíveis de origem animal são compostos de proteínas ECM e fatores de crescimento que suportam a manutenção celular. Como a ECM possui propriedades específicas do tecido que podem modular o destino celular, matrizes livres de xeno são usadas para transmitir a tradução para estudos clínicos. Embora as matrizes comercialmente disponíveis sejam amplamente utilizadas no trabalho com hiPSC e organoides, a equivalência dessas matrizes ainda não foi avaliada. Aqui, foi realizado um estudo comparativo da manutenção de hiPSC e geração de organoides intestinais humanos (hIO) em quatro matrizes diferentes: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB) e VitroGel (Matrix 4-XF). Embora as colônias não tivessem uma forma perfeitamente redonda, houve uma diferenciação espontânea mínima, com mais de 85% das células expressando o marcador de células-tronco SSEA-4. A Matrix 4-XF levou à formação de aglomerados redondos 3D. Além disso, o aumento da concentração de suplemento e fatores de crescimento no meio usado para fazer a solução de hidrogel Matrix 4-XF melhorou a expressão de hiPSC de SSEA-4 em 1,3 vezes. A diferenciação do hiPSC mantido pela Matrix 2-AB levou a menos liberações de esferóides durante o estágio médio / intestino grosso em comparação com as outras membranas basais derivadas de animais. Em comparação com outras, a matriz organoide livre de xeno (Matriz 4-O3) leva a uma IO maior e mais madura, sugerindo que as propriedades físicas dos hidrogéis livres de xeno podem ser aproveitadas para otimizar a geração de organoides. Em conjunto, os resultados sugerem que variações na composição de diferentes matrizes afetam os estágios de diferenciação de IO. Este estudo aumenta a conscientização sobre as diferenças nas matrizes disponíveis comercialmente e fornece um guia para a otimização da matriz durante o trabalho de iPSC e IO.

Introduction

A matriz extracelular (MEC) é um componente dinâmico e multifuncional dos tecidos que desempenha um papel central na regulação do comportamento e desenvolvimento celular. Como uma rede complexa, fornece suporte estrutural, ligantes adesivos celulares¹ e armazenamento de fatores de crescimento e citocinas que regulam a sinalização celular. Por exemplo, durante a cicatrização de feridas, a MEC serve como um andaime para células migratórias e como um reservatório de fatores de crescimento envolvidos no reparo tecidual². Da mesma forma, a desregulação na MEC pode levar a um aumento na gravidade de várias doenças, como fibros....

Protocol

1. manutenção hiPSC

CUIDADO: Todo o trabalho é feito em um Gabinete de Biossegurança (BSC) seguindo técnicas assépticas padrão. Deve seguir os padrões de segurança da OSHA para laboratórios, incluindo o uso adequado de equipamentos de proteção individual, como jalecos, luvas e óculos de proteção.

1. Preparação de matrizes, alíquotas e meios de cultura celular
   1. Para membranas basais (BMs) derivadas de animais disponíveis comercialmente; Matriz 1-.......

Discussion

Selecionar o microambiente ideal para o trabalho com células-tronco e organoides é um passo inicial fundamental ao usar essas plataformas para uma ampla gama de aplicações. Nossos resultados representativos mostram que a Matriz 4-XFO3, em combinação com uma maior concentração de fatores de crescimento, leva a organoides maiores, sugerindo que as propriedades físicas dos hidrogéis livres de xeno podem ser aproveitadas para otimizar a geração de organoides usando esses sistemas. Foi demonstrado anteriormente qu.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-Well Plate (Culture treated, sterile)	Falcon	353504
37 °C water bath	VWR
96-well plate	Fisher Scientific	FB012931
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634
Anti-adherence Rinsing Solutio	STEMCELL Technologies	7010
Biological safety cabinet (BSC)	Labconco	Logic
Brightfield Microscope	Echo Rebel	REB-01-E2
BXS0116	ATCC	ACS-1030
Centrifuge with temperature control (4 °C capabilities)	ThermoScientific	75002441
Conical tubes, 15 mL, sterile	Thermo Fisher Scientific	339650
Conical tubes, 50 mL, sterile	Thermo Fisher Scientific	339652
Cultrex RGF BME, Type 2	Bio-techne	3533-005-02
Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME	Bio-techne	3434-010-02
D-PBS (Without Ca++ and Mg++)	Thermo Fisher Scientific	14190144
GeltrexLDEV-Free, hESC-Qualified Reduce Growth Factor	Gibco	A14133-02
GlutaMAX Supplement	Thermo Fischer Scientific	35050-061
Guava Muse Cell Analyzer or another flow cytometry equipment (optional)	Luminex	0500-3115
HEPES buffer solution	Thermo Fischer Scientific	15630-056
Heralcell Vios Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2)	Thermo Scientific	51033775
JMP Software	SAS Institute	JMP 16
MATLAB	MathWorks, Inc	R2022b
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix LDEV free	Corning	356231
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Growth Factor Reduced (GFR) LDEV-free	Corning	354263
mTeSR Plus Medium	STEMCELL Technologies	100-0276
Nunclon Delta surface treated 24-well plate	Thermo Scientific	144530
PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM)	BD Pharmingen	566841
PE Mouse Anti-human CDX2	BD Pharmingen	563428
PE Mouse Anti-human FOXA2	BD Pharmingen	561589
PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-human SSEA4	BD Pharmingen	561565
ReLeSR	STEMCELL	5872
SCTi003-A	STEMCELL Technologies	200-0510
Serological pipettes (10 mL)	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipettes (5 mL)	Fisher Scientific	13-678-11D
STEMdiff Intestinal Organoid Growth Medium	STEMCELL Technologies	5145
STEMdiff Intestinal Organoid Kit	STEMCELL Technologies	5140
Vitrogel Hydrogel Matrix	TheWell Bioscience	VHM01
VitroGel ORGANOID Discovery Kit	TheWell Bioscience	VHM04-K