El protocolo en este estudio proporciona una estrategia de combinación de dos hierbas para tratar las células PC12 dañadas por hipoxia, y una referencia para optimizar el mejor modo de combinación de hierbas. Esta técnica puede proporcionar un método experimental in vitro simple, confiable y eficiente para detectar la combinación efectiva de ingredientes de hierbas, contra células hipoxiales. Esta estrategia también se puede aplicar para examinar las combinaciones de componentes contra las células hipoxiales de otras combinaciones de preparación de hierbas, e ilustrar su mecanismo de protección.
Para empezar, subcultive las células PC12 cada dos o tres días a 37 grados centígrados en una incubadora suplementada con 5% de dióxido de carbono para obtener un paso de 4 a 8 para todos los experimentos posteriores. Trate de 70 a 80% de células PC12 confluentes con un mililitro de 0,25% de tripsina, y observe las células bajo un microscopio para el desprendimiento celular. Luego detenga la digestión de tripsina agregando tres mililitros del medio completo.
Haga girar las células transferidas en un tubo de centrífuga de 15 mililitros a 840 x g durante cinco minutos. Después de desechar el sobrenadante, resuspenda el pellet celular con el medio completo y transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Para contar las células, inicie el software de citometría de flujo y seleccione el múltiplo de dilución correspondiente de la solución celular en el ajuste de recuento.
Haga clic en Gráfico de densidad después de cargar la muestra de celda. Rodee la población celular lejos del eje x y del eje y. Haga clic con el botón secundario en la tabla de datos situada debajo de la figura y seleccione X, Y, Count y Abs.
Count para obtener los resultados del recuento de celdas en la tabla de datos de Abs.Count. Después de ajustar la concentración celular aproximadamente a 1 veces 10 a la 5ª célula por mililitro con el medio completo, agregue 100 microlitros de la suspensión celular por pocillo a una placa de 96 pocillos e incube a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Al día siguiente, a la placa desechada por sobrenadante, agregue 120 microlitros de un miligramo por mililitro de solución MTT en cada pocillo e incube durante cuatro horas a 37 grados centígrados.
Después de la incubación, una vez que se deseche el sobrenadante, agregue 150 microlitros de DMSO a cada pocillo. Mantenga la placa bajo agitación en un oscilador de vórtice durante 10 minutos a una velocidad de 240 veces por minuto. Luego mida la absorbancia a 490 nanómetros en un lector de microplacas.
Para detectar la combinación óptima de fármacos mediante el método de diseño homogéneo, cultivar las células como se demostró anteriormente y tratar las células PC12 lesionadas con seis concentraciones de proporción diferentes de inyección de astrágalo y cápsula de breviscapus. Para evaluar el efecto protector de dos combinaciones óptimas, trate las células PC12 lesionadas con los dos tipos de combinación de fármacos. Incubar las células durante 24 horas y calcular la viabilidad celular como se demostró anteriormente.
Sembrar las células PC12 en una placa de 12 pocillos e incubar a 37 grados centígrados durante 24 horas. Después del tratamiento farmacológico, tratar las células con 250 microlitros de tripsina por pocillo y centrifugar las células a 840 x g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego vuelva a suspender el pellet celular con 500 microlitros del tampón de unión.
Agregue 5 microlitros de Annexin V-FITC, 10 microlitros de yoduro de propidio por triplicado para cada grupo e incube las células en la oscuridad durante 15 minutos a temperatura ambiente para verificar la apoptosis mediante citometría de flujo. En el software del citómetro de flujo, haga clic en Compensación automática en el menú Inicio, seleccione FITC, PE, PerCP y APC en el canal Seleccionar y seleccione Compensación en altura. A continuación, haga clic en Aceptar en el elemento estadístico:Mediana.
Haga clic en Mapa de densidad y encierre en un círculo la población celular efectiva con el método de recuento de células demostrado anteriormente. Con la fluorescencia FITC como parámetro del eje x y otra fluorescencia como parámetro del eje y, cree un mapa de densidad. Haga clic en Matriz de compensación en el menú Inicio y Coeficiente en la matriz de desbordamiento.
Sembrar las células PC12 en los cubreobjetos colocados en un pozo de placa de 24 pocillos por triplicados, e incubar a 37 grados centígrados durante 24 horas. Después del tratamiento farmacológico, enjuague los cubreobjetos dos veces con PBS durante cinco minutos cada uno, fíjelos con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos y permeabilice con Triton X-100 al 0,5% durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de enjuagar las células, bloquearlas con suero de cabra al 10% durante una hora a temperatura ambiente.
Agregue 200 microlitros de anticuerpo primario diluido caspasa-3 a cada cubreobjetos e incube durante la noche a 4 grados centígrados. Al día siguiente, lavar tres veces con tampón TBST durante tres minutos cada una, e incubar con 200 microlitros de anticuerpo secundario durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la incubación, incube los cubobjetos con 300 microlitros de 0,5 microgramos por mililitro de DAPI durante 10 minutos y lave las células tres veces con TBST durante cinco minutos cada una.
Capture las imágenes de la cubierta bajo un microscopio de fluorescencia y analice estadísticamente la intensidad de fluorescencia con el software de imágenes. Lave el cubreobjetos de células PC12 tratado con medicamentos tres veces con PBS durante tres minutos cada una e incube con 400 microlitros de 10 diacetato de dicloro-dihidrofluoresceína micromolar a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Lave las células nuevamente con DMEM sin suero dos veces durante tres minutos cada una.
Agregue el agente de extinción de fluorescencia e inmediatamente capture las imágenes de la cubierta bajo un microscopio de fluorescencia para calcular la intensidad relativa de fluorescencia con el software de imágenes. Lave las células PC12 tratadas con medicamentos en una placa de 6 pocillos tres veces con PBS durante cinco minutos cada una, e incube en hielo durante 30 minutos en el tampón de lisis preparado de 100 microlitros por pocillo. Después de la lisis, centrifugar las células a 16, 000 x g durante 20 minutos a 4 grados centígrados para recoger el sobrenadante.
Después de detectar la concentración de proteína mediante el ensayo de Bradford, ejecute una electroforesis SDS-PAGE al 12% con 25 microgramos de proteína en cada carril y transfiera el gel a la membrana de PVDF. Bloquear las membranas con leche descremada al 5% durante 1,5 horas a temperatura ambiente, e incubar con cinco mililitros de los anticuerpos primarios correspondientes durante 24 horas a 4 grados centígrados. Después de incubar y lavar la membrana con TBST tres veces durante 10 minutos cada una, incubar con cinco mililitros de anticuerpos secundarios conjugados con HRP a temperatura ambiente durante dos horas.
Finalmente, a la membrana lavada con TBST, agregue sustrato HRP quimioluminiscente para la detección de bandas de proteínas según las instrucciones del fabricante. Luego capture las imágenes utilizando el sistema de imágenes de quimioluminiscencia para cuantificar los valores de gris de las proteínas, con beta-actina como control interno. La viabilidad celular en las células PC12 normales fue inferior al 95% con inyección de astrágalo a concentraciones superiores a 12 micromolares y mayores de 5 micromolares para la cápsula de breviscapus.
La inyección de astrágalo podría mejorar la tasa de supervivencia de las células PC12 lesionadas en el rango de concentración de 6 a 12 micromolares, y la cápsula de breviscapus de 2 a 5 micromolares. Mientras que la combinación de fármacos en una proporción de 6 a 1,8 micromolares exhibió la mayor viabilidad celular. La viabilidad celular de las dos combinaciones en las células PC12 lesionadas se promovió significativamente, y la combinación de componentes fue superior a la combinación de preparación.
La tasa de apoptosis mostró que los porcentajes de células apoptóticas tempranas, tardías y totales fueron significativamente mayores en el grupo modelo que en el grupo normal. En comparación con el grupo modelo, los porcentajes de células apoptóticas en cada etapa fueron significativamente menores en el grupo de tratamiento. La intensidad de fluorescencia de la caspasa-3 fue significativamente menor en cada grupo de tratamiento en comparación con el grupo modelo, y fue relativamente menor en el grupo de combinación de componentes.
La expresión relativa de los genes Akt, Bcl-2 y Bax reveló que la combinación de componentes es superior a la combinación de preparación para promover la supervivencia celular, que está relacionada con el efecto anti-apoptosis más fuerte. La combinación de componentes exhibió un mejor efecto de daño antioxidante que el de la combinación de preparación, y una expresión significativamente mayor de la proteína Nrf2. Este método se puede utilizar para detectar y evaluar la combinación de componentes con otras actividades farmacológicas potenciales de la combinación de hierbas, como antiinflamatorios, antibacterianos y más.
