이 프로토콜의 전반적인 목표는 유동 세포형을 통해 이중 형광 세포를 측정하여 BK-polyomavirus 비코딩 제어 영역 구동 전사 활성을 측정하는 것입니다. BK-polyomavirus는 면역 손상한 환자에 있는 가혹한 병리를 일으키는 원인이 될 수 있습니다, 특히 신장 이식 수신자에서. 그러나, 매우 효과적인 바이러스 백신은 현재 사용할 수 없기 때문에, 다른 화합물의 잠재적인 항 바이러스 영향을 측정 하는 방법이 필요.
이 방법을 통해 바이러스 학자들은 비코딩 제어 영역에 의해 구동되는 BK-polyomavirus 전사 활동에 영향을 미치는 잠재적 인 항 바이러스 제의 영향을 분석 할 수 있습니다. 이 분석법은 또한 전형적인 비코딩 제어 영역에 비해 프로모터 활동에 대한 재배열의 영향을 연구할 수 있게 한다. 이중 형광 보고서와 함께 바이러스 프로모터 활성을 연구하는 장점은 조기 및 후기 유전자 발현을 상호 독립적으로 분석할 수 있다는 점입니다.
더욱이, 바이러스증및 장기전성세포 배양실험의 어려운 천공은 전염및 형광세포만 분석되기 때문에 필요하지 않으며, 세포 생존력과 천공을 감소시키는 약물도 연구할 수 있다. 이 프로토콜은 뒤스부르크 에센 대학의 의학 교수의 윤리위원회에 의해 승인된 인간 연구의 지침을 따릅니다. 첫 번째 단계는 다종 바이러스 DNA의 격리를 위한 혈액 샘플을 수집하는 것입니다.
EDTA 획득 튜브에서 적어도 3 밀리리터의 혈액을 수집합니다. 샘플을 2, 500 G에서 15분 동안 원심분리하고 플라즈마를 새로운 튜브로 피펫합니다. 단백질 SK 40마이크로리터를 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 준비하고 파이펫팅을 통해 400마이크로리터 플라즈마를 추가합니다.
제조업체의 지침에 설명된 대로 DNA 얼룩 추출 키트를 사용하여 DNA를 분리합니다. 프라이머 쌍 A를 사용하여 사전 PCR에 대한 마스터 믹스를 총 50 마이크로리터로 준비하고 이전에 격리된 DNA를 사용합니다. 마스터 믹스의 45 마이크로리터를 PCR 튜브에 분배합니다.
PCR 튜브에 격리 된 DNA의 5 마이크로 리터를 추가하고 표 3에 도시 된 바와 같이 반응 조건으로 PCR을 실행합니다. 35사이클에서 반복 적인 변성 어닐링 및 확장을 반복합니다. 중첩 된 응용 프로그램의 경우 복제에 대한 제한 사이트를 수용 하는 프라이머 쌍 B를 사용합니다.
PCR 제품의 마이크로리터 10개를 6배 젤 로딩 염료 2개의 마이크로리터와 혼합합니다. 1.5% 아가로즈 젤에 믹스 10 마이크로리터를 적재하고 60 밀리암페어에서 30분 동안 젤을 실행합니다. 적절한 UV 문서화 시스템을 사용하여 젤을 시각화합니다.
제조업체의 지침에 따라 PCR 정화 키트를 사용하여 PCR 앰플리턴을 정화합니다. 섭씨 37도에서 2시간 동안 지표 제한 효소로 정제된 앰플리턴을 소화합니다. 소화된 앰플리턴을 정화하기 위해 정화 단계를 반복합니다.
동시에 플라스미드 백본을 소화합니다. 소화된 플라스미드 백본을 0.8% 낮은 마운트 아가로즈 젤로 분석합니다. 40 밀리암페어보다 높은 전류에서 젤을 실행하지 마십시오.
긴 파도 UV 빛을 사용하여 DNA 조각을 시각화하고 깨끗한 메스를 사용하여 구부러진 백본을 잘라냅니다. DNA 손상을 방지하기 위해 긴 UV 노출 시간을 피하십시오. 새로운 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리튜브로 플로멜 젤 조각 조각에 대한 울타리.
낮은 모드 아가로즈 조각을 함유한 백본을 섭씨 65도에서 10분간 가열하여 젤 조각을 녹이고 2분마다 부드러운 소용돌이로 섞습니다. 용융 젤은 결찰에 직접 사용할 수 있습니다. Ligate 백본과 T4 DNA 리개아제를 사용하여 소화된 앰플리코가 섭씨 16도에서 하룻밤 을 지니게 합니다.
표준 복제 절차 후 플라즈마 DNA를 분리합니다. 제한 효소 소화를 수행하여 양성 클론을 확인하고 1% 아가로즈 젤에서 소화된 조각을 시각화합니다. 종자 100, 000 HEK293T 세포는 12웰 플레이트 의 웰 당 24시간 전 과배및 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하고, 형질 전환 시 활성 증식을 유지한다.
세포는 경질에서 대략 80%의 합류에 있어야 합니다. 멸균 튜브에 감소 된 혈청 매체250 마이크로 리터를 넣고 보고된 각 플라즈마 DNA의 마이크로그램을 추가하고 파이펫팅으로 부드럽게 섞습니다. DNA 혼합물에 3개의 마이크로리터를 추가하고 피펫팅하여 부드럽게 섞어 섭씨 22도에서 15분 동안 배양합니다.
혼합물을 넣고 우물에 드롭와이즈를 넣고 웰에 부드럽게 분배합니다. 4시간 후, 상체를 테스트 에이전트 및 용매 제어를 포함하는 신선한 매체로 교체하십시오. 이 예에서, mTOR 억제제 INK-128 및 라파마이신이 사용되었다.
분석전까지 섭씨 37도에서 배양합니다. 형광 현미경의 밑에 적색과 녹색 형광을 위한 세포를 검사합니다. 적색 및 녹색 형광은 각각 초기 및 후기 BK-폴리오메 바이러스 유전자 발현에 대응한다.
72 시간 후 트랜스포션, 신중하게 상체를 갈망. 차가운 PBS의 1 밀리리터로 세포를 두 번 씻으시면 됩니다. 부드럽게 500 마이크로 리터 트립신을 추가하고 세포의 조기 분리를 피하기 위해 약간 접시를 켭니다.
이 단계는 셀 더블을 방지하는 것이 중요합니다. 또한 트립신은 동일한 파이펫 팁으로 직접 제거됩니다. 섭씨 37도에서 적어도 5분 동안 세포를 배양한다.
트립신 S 세포를 3%FCS를 함유한 1밀리리터 PBS로 다시 중단하고 사전 표지된 FACS 튜브에서 서스펜션을 전송합니다. FACS 분석 전에 밀리리터당 1마이크로그램의 농도에 DAPI를 추가합니다. 유동 세포계를 사용하여 세포를 분석합니다.
각 샘플에 대해, 적어도 10, 000 살아있는 세포를 측정합니다. 정확한 결과를 얻기 위해서는 빨간색 및 녹색 신호를 구별하는 데 초기 보상이 필수적입니다. 비코딩 제어 리젠트는 복제에 대한 제한 부위를 수용하는 내부 프라이머 쌍을 사용하여 중첩된 PCR 프로토콜을 사용하여 증폭되었다.
앰플리콘 검증은 아가로즈 겔 전기전도를 통해 수행되었지만 겔내 균질 크기 분포에서 전형적인 NCCR 서열에서 유래된 앰플리콘은 삽입 및 삭제를 가진 재배열된 NCC에서 유래한 앰플리콘이 크기가 달랐다. NCCR을 포함하는 양수 클론의 선택은 제한 분석에 의해 확인되었다. 작은 스페이서 영역은 양수 클론을 나타내는 더 큰 NCCR 조각으로 대체되었습니다.
검증된 클론으로부터 분리된 플라스미드 DNA가 피로세퀀싱을 위해 보내졌다. 이 예에서는, P 블록내의 삭제 및 O-블록의 대체가 검출되었다. HEK293T 세포는 보고 가능한 구조에 대한 존중으로 과도하게 전염되었고 NCCR 활성은 형광 현미경 검사법에 의해 모니터링되었다.
적색 및 녹색 형광은 각각 초기 및 후기 BK-폴리오메 바이러스 유전자 발현에 대응했다. 제1 NCCR은 강한 후기 유전자 발현을 보였고 두 번째 예는 비교적 강하지만 중간 정도의 후기 유전자 발현을 보였다. DAPI 네거티브 셀이 게이트되고 tdTomato 대 eGFP를 보여주는 점 플롯이 만들어졌습니다.
tdTomato 또는 eGFP에 대한 긍정적뿐만 아니라 부정적인 샘플은 분석에만 포함되었습니다. 평균 형광 강도는 각 테스트 클론에서 파생되었다. 이 예에서, 이중 mTOR 억제제 INK128을 통한 치료는 tdTomato MFI를 현저히 감소시켰으며 이는 조기 발현이 억제되었다는 것을 의미한다.
이 방법을 사용하면 전사 활성을 통해 BK-polyomavirus를 검출하기 위해 현재 사용되고 있는 다른 화합물을 식별할 수 있습니다. 초기 유전자 발현에서, 이것은 확실히 바이러스성 연루를 결정합니다. 억제 방울은 BK-polyomavirus 재활성화의 경우 면역 손상된 환자를 위한 에이전트로서 사용되는 것으로 간주될 수 있다.
