저희 연구실은 노화와 신경퇴행성 질환에서 발생하는 망막과 중추신경계 전반의 대사 변화를 조사합니다. 우리의 최우선 목표는 이러한 연구 결과를 활용하여 노화 관련 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한 새로운 치료 표적을 식별하는 것입니다. 망막 조직에서 포도당 흡수를 감지하는 것은 종종 비용과 시간이 많이 소요되며 복잡한 이미징 방식이나 방사성 물질이 필요합니다.
당사는 망막 샘플에서 형광 포도당 아날로그 흡수를 측정하기 위한 새로운 생체 외 기술을 제공하기 위해 이 프로토콜을 수립했습니다. 우리가 개발한 프로토콜은 형광 포도당 유사체가 온전한 망막 전체로 체외 흡수를 측정할 수 있는 간단하고 비용 효율적인 전략을 제공합니다. 이 방법은 연구원이 여러 샘플을 동시에 측정할 수 있기 때문에 유리합니다.
이 프로토콜을 통해 연구자들은 형광 포도당 유사체의 망막 흡수 변화를 평가할 수 있으며, 이는 망막이 노화와 건강 및 질병 상태 모두에서 포도당을 에너지 기질로 사용하는 방법을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 먼저 50% DMSO와 PBS의 혼합물에 5밀리몰 6-NBDG의 원액을 준비합니다. 용액의 500마이크로리터 분취량을 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.
포도당이 없는 Neurobasal-A Medium이 들어 있는 50ml 원뿔형 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브를 피어싱 분석을 위한 포도당 결핍, 6-NBDG 배양, 초음파 처리 및 시료 채취로 표시합니다. 100마이크로리터의 냉각된 Neurobasal-A 배지를 얼음 위의 사전 라벨링된 초음파 처리 튜브에 추가합니다.
플레이트 리더의 전원을 켭니다. 여기(excitation)를 483나노미터로, 방출(emission)을 550나노미터로, 컷오프(cutoff)를 530나노미터로 설정한 형광 종말점 분석 기능을 사용하여 플레이트 리더 소프트웨어에서 플레이트 매개변수를 설정합니다. Neurobasal-A Media에서 6 NBDG의 5 밀리몰 스톡 용액을 희석하여 500 마이크로 몰 작업 용액을 준비하고 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 덮습니다.
200 마이크로 리터의 작업 용액을 사전 라벨링 된 6-NBDG 배양 튜브에 피펫팅하고 시연된대로 덮습니다. 트리밍된 전사 피펫 또는 핀셋을 사용하여 안락사된 쥐로부터 망막을 분리한 후, 포도당 결핍을 위해 200마이크로리터의 Neurobasal-A 배지가 들어 있는 1.5ml 튜브로 망막을 옮깁니다. 섭씨 37도의 수조에서 튜브를 20분 동안 배양합니다.
Neurobasal-A 배지에서 200마이크로리터의 500마이크로몰 6-NBDG가 들어 있는 사전 라벨링된 튜브로 망막을 옮깁니다. 튜브를 섭씨 37도의 수조에서 60분 동안 배양합니다. 6-NBDG 표준물질을 준비하려면 8개의 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브를 표준 1 - 8로 표시합니다.
표준 용액의 경우, 32마이크로리터의 500마이크로몰 6-NBDG 원액을 라벨이 부착된 튜브에 피펫팅합니다. 그런 다음 368 마이크로리터의 Neurobasal-A 배지를 튜브에 넣고 위아래로 피펫팅하여 완전히 혼합합니다. 모든 튜브를 알루미늄 호일로 덮으십시오.
60분 6-NBDG 배양 후 섭씨 37도의 수조에서 튜브를 제거합니다. 망막을 세척하려면 망막 조직을 방해하지 않고 피펫을 사용하여 6-NBDG 용액을 제거하고 얼음에 500마이크로리터의 신선한 얼음처럼 차가운 Neurobasal-A Medium을 추가합니다. 다음으로, 겸자를 사용하여 얼음 위의 Neurobasal-A Medium이 들어있는 초음파 튜브로 망막을 조심스럽게 옮깁니다.
작은 해부 가위를 사용하여 망막을 작은 조각으로 자릅니다. 각 망막을 10의 진폭으로 5-10초 동안 초음파 처리한 다음 즉시 튜브를 얼음 위에 다시 놓습니다. 섭씨 4도에서 15분 동안 21, 130G에서 샘플을 원심분리합니다.
100마이크로리터의 상등액을 96웰 플레이트로 옮깁니다. 플레이트 리더에 플레이트를 삽입합니다. 지정된 파장을 가진 형광 종말점 분석을 선택합니다.
분석을 실행하고 결과를 저장합니다. 실행 후 피어싱 분석을 위해 96웰 플레이트의 샘플을 사전 라벨링된 튜브에 피펫팅합니다. 사전 희석된 pierce assay 단백질 표준물질을 사용하여 각 표준물질 10마이크로리터를 96웰 투명 바닥 플레이트에 복제하여 추가합니다.
그런 다음 10마이크로리터의 샘플을 플레이트로 옮깁니다. 150마이크로리터의 피어싱 시약을 표준물질 또는 샘플이 포함된 모든 웰에 추가합니다. 접시를 덮고 접시 셰이커에 중간 속도로 1분 동안 섞습니다.
플레이트를 실온에서 5분 동안 배양합니다. 플레이트를 플레이트 리더에 삽입하고 파장을 660나노미터로 설정한 흡광도 종말점 분석을 선택합니다. 표준물질 및 샘플의 흡광도를 측정하고, 결과를 저장하고, 표준 곡선을 그려 각 샘플의 총 마이크로그램 단백질을 측정합니다.
포도당 형광 측정은 야생형 마우스 망막에서 배양 30분 후 6-NBDG 흡수가 증가하여 60분에서 최고조에 달한 후 90분 후에 임의 단위가 감소하는 것을 보여주었습니다. GLUT1 억제제인 bay 876의 추가는 6-NBDG 흡수를 24% 감소시켰으며, 이는 야생형 마우스 망막에서 GLUT1 독립 메커니즘의 관여를 나타냅니다.
