Este protocolo descreve a geração de gordura termogênica tridimensional vascularizada e funcional a partir de fragmentos microvasculares, ou MVFs. As estratégias atuais de engenharia de tecido adiposo termogênico são complexas e não retratam completamente suas propriedades multicelulares e funcionais. As MVFs são uma fonte única de células que permitem a vascularização e a formação de tecido adiposo.
Sendo um método simples de fonte única para criar imitações biológicas de gordura bege, os MVFs têm um potencial significativo para promover a compreensão ou o desenvolvimento de tratamentos para obesidade e doenças metabólicas. Colocar o animal adequadamente tricotelado e eutanasiado tratado com etanol 70% em decúbito dorsal e iniciar o isolamento da gordura inguinal. Levante a pele abaixo do pênis com uma tesoura e realize a incisão, começando pelo centro e cortando lateralmente, formando um formato de V, antes de fazer um loop até a parte de trás do animal para acessar todo o depósito de gordura.
Durante o corte, garanta a separação da pele da gordura cortando o tecido da fáscia interconectado. Uma vez que a fáscia é adequadamente cortada, certifique-se de que a gordura inguinal de ambos os lados, estendendo-se da virilha para trás, é visível. Em seguida, retire a gordura dos dois lados em tubos cônicos separados contendo 10 mililitros de BSA em PBS, com uma concentração de um miligrama por mililitro.
Para colher a gordura epididimal, corte através da pele abdominal, seguido de cortar cuidadosamente a fina camada que envolve os testículos. Puxe suavemente o tecido adiposo usando pinças e corte-o usando tesoura, evitando a dissecção de quaisquer vasos sanguíneos visíveis importantes. Agora, coloque a gordura removida em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 10 mililitros de um miligrama por mililitro BSA em PBS.
Para isolar a gordura subcutânea posterior, vire o rato de bruços e use uma tesoura grande para cortar a pele grossa das costas até o couro cabeludo, tomando cuidado para não cortar muito fundo abaixo da pele. Corte a fáscia que liga a pele ao tecido. Diferenciar a gordura subcutânea, localizada na região intraescapular, da gordura marrom localizada mais próxima à coluna vertebral antes de isolar e colocar a gordura subcutânea em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 10 mililitros de um miligrama por mililitro de SC em PBS.
Enquanto estiver trabalhando dentro de um biohood, use fórceps para colocar a gordura excisada em uma placa de Petri padrão de 100 mililitros contendo 0,5 mililitros de um miligrama por mililitro de BSA em PBS. Remova quaisquer vasos sanguíneos visíveis, músculos ou tecido estranho da gordura. Usando uma tesoura, pique a gordura por 10 minutos e verifique se há caroços adicionando um pouco mais de BSA.
Continue picando, se necessário, antes de transferir a suspensão de gordura picada para um balão estéril de 250 mililitros com uma pipeta de 10 mililitros. Aumentar o volume no frasco até 20 mililitros adicionando BSA suficiente em PBS. Agora adicione BSA em PBS à colagenase e homogeneize a solução agitando-a suavemente antes de filtrá-la estéril através de um filtro líquido de nylon de 0,22 mícron.
Adicione imediatamente a quantidade necessária de solução de colagenase à suspensão de gordura picada e digerir a gordura agitando o balão em movimento circular em banho-maria a 37 graus Celsius durante o período de tempo adequado. Transfira a gordura digerida para um tubo cônico de 50 mililitros rotulado como gordura digerida ou gordura picada. Centrifugar o tubo a 400 G por quatro minutos para girar os fragmentos microvasculares, ou MVFs, em uma pastilha vermelha.
Decantar suavemente o sobrenadante em um tubo cônico de 50 mililitros rotulado como resíduo sem perturbar o pellet. Em seguida, adicione 10 mililitros de um miligrama por miligrama de BSA em PBS ao tubo que contém o pellet e misture a suspensão do pellet pipetando-o suavemente para cima e para baixo duas vezes sem interromper os fragmentos. Agora, pegue a tela de 500 mícrons pré-embebida em uma placa de Petri estéril contendo cinco mililitros de um miligrama por mililitro BSA em PBS e coloque-a sobre o suporte de tela de plástico mantido em uma nova placa de Petri.
Pipetar 10 mililitros de suspensão do tubo de pellet digerido para a tela em círculos concêntricos. Lave o filtro com mais cinco mililitros de um miligrama por mililitro de BSA em PBS e elimine-o, mantendo o filtrado dentro da placa de Petri. Em seguida, coloque a tela pré-embebida de 37 mícrons acima do suporte de tela de plástico em uma nova placa de Petri.
Usando uma pipeta fresca, transfira o filtrado da primeira filtração para a tela em círculos concêntricos. Como descrito anteriormente, lave a tela com BSA em PBS e, desta vez, descarte o filtrado mantendo a tela de 37 mícrons. Deslize a tela de 37 mícrons em uma nova placa de Petri contendo cinco mililitros de um miligrama por mililitro BSA em PBS.
Desalojar os fragmentos batendo suavemente o prato contra um suporte cônico, sem derramar nenhum líquido. Enxaguar o filtro com mais cinco mililitros de BSA em PBS. Em seguida, transfira o líquido da placa de Petri para um tubo cônico estéril de 50 mililitros.
Enxágue a tela de 37 mícrons várias vezes, adicionando a lavagem ao tubo cônico até que o volume total coletado seja de 15 a 20 mililitros. Descarte a tela após o enxágue final. Corte a extremidade de uma ponta de pipeta de 20 microlitros usando uma tesoura.
Agite suavemente o tubo que contém o líquido antes de retirar duas alíquotas de 20 microlitros usando a ponta da pipeta cortada e pipetar cada uma das alíquotas em uma placa de Petri limpa de 35 milímetros. Contar o número de fragmentos da amostra em cada placa de Petri utilizando um microscópio de luz padrão e, utilizando a fórmula mencionada no manuscrito, obter o número total de fragmentos microvasculares isolados. Gire o líquido restante no tubo cônico de 50 mililitros a 400 G por quatro minutos para coletar a FMV.
Após a fiação, decantar a maior parte do sobrenadante do tubo cônico e usar uma pipeta para remover o pequeno volume de líquido remanescente na borda do tubo. Em seguida, adicione trombina nos orifícios designados para fundição de géis. Corte a extremidade de uma ponteira de pipeta de 200 microlitros e, usando-a, ressuspenda suavemente as MVFs em fibrinogênio para obter a densidade final desejada.
Pipetar a suspensão para a solução de trombina no poço e homogeneizar rapidamente a mistura pipetando para cima e para baixo. Depois que todos os géis estiverem fundidos, coloque a placa do poço em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por cerca de 15 minutos para permitir a reticulação do gel. Os lipídios e os adipócitos diferenciados foram observados por microscopia confocal dos hidrogéis usando BODIPY como coloração lipídica.
A cultura de tecido adiposo não vascularizado usando meios adipogênicos brancos ou beges resultou na formação de tecido adiposo branco ou bege não vascularizado, respectivamente, tanto de MVFs magros quanto de roedores diabéticos. Da mesma forma, a cultura de tecido adiposo vascularizado usando meios adipogênicos brancos ou beges resultou na formação de tecido adiposo branco ou bege vascularizado, respectivamente, a partir das MVFs derivadas de roedores.
A capacidade das MVFs de se diferenciarem em tecido adiposo bege foi geneticamente confirmada usando RT-qPCR. MVFs de roedores magros e diabéticos expostos a meios adipogênicos brancos diretos ou beges foram avaliados quanto à adipogênese, termogênese e angiogênese. A expressão da proteína desacopladora 1, como esperado, foi significativamente maior no tecido adipogênico bege.
Uma tendência semelhante foi observada em MVFs de roedores expostos a meios adipogênicos brancos ou beges indiretos, bem como em MVFs humanos expostos a meios adipogênicos brancos diretos ou beges. Por fim, a partir da bioenergética mitocondrial, ficou evidente que, funcionalmente, o tecido adiposo bege apresentou taxa de consumo de oxigênio caracteristicamente mais elevada, ou OCR, em todos os casos. A digestão enzimática do tecido adiposo deve ser otimizada para reproduzir consistentemente MVFs de tamanho e qualidade semelhantes.
Após a digestão, os MVFs devem ser manuseados suavemente, com cuidado especial para evitar a quebra dos fragmentos. Essa técnica auxiliou no equilíbrio do crescimento vascular e na diferenciação dos adipócitos, comprovadamente dependentes dos fatores introduzidos.
