Flux de travail expérimental et d’analyse de données pour la nanoindentation de matière molle

Résumé

Le protocole présente un flux de travail complet pour les expériences de nanoindentation de matériaux mous, y compris les hydrogels et les cellules. Tout d’abord, les étapes expérimentales pour acquérir des données de spectroscopie de force sont détaillées; ensuite, l’analyse de ces données est détaillée par un logiciel Python open-source nouvellement développé, téléchargeable gratuitement à partir de GitHub.

Résumé

La nanoindentation fait référence à une classe de techniques expérimentales où une sonde de force micrométrique est utilisée pour quantifier les propriétés mécaniques locales des biomatériaux mous et des cellules. Cette approche a acquis un rôle central dans les domaines de la mécanobiologie, de la conception de biomatériaux et de l’ingénierie tissulaire, afin d’obtenir une caractérisation mécanique correcte des matériaux mous avec une résolution comparable à la taille des cellules individuelles (μm). La stratégie la plus populaire pour acquérir de telles données expérimentales consiste à utiliser un microscope à force atomique (AFM); Bien que cet instrument offre une résolution sans précédent en force (jusqu’au pN) et en espace (sub-nm), sa facilité d’utilisation est souvent limitée par sa complexité qui empêche les mesures de routine d’indicateurs intégraux des propriétés mécaniques, tels que le module de Young (E). Une nouvelle génération de nanopénétrateurs, tels que ceux basés sur la technologie de détection de fibre optique, a récemment gagné en popularité pour sa facilité d’intégration tout en permettant d’appliquer des forces inférieures à nN avec une résolution spatiale en μm, ce qui convient pour sonder les propriétés mécaniques locales des hydrogels et des cellules.

Dans ce protocole, un guide étape par étape détaillant la procédure expérimentale pour acquérir des données de nanoindentation sur des hydrogels et des cellules à l’aide d’un nanopénétrateur de détection de fibre optique sur virole disponible dans le commerce est présenté. Alors que certaines étapes sont spécifiques à l’instrument utilisé ici, le protocole proposé peut servir de guide pour d’autres dispositifs de nanoindentation, à condition que certaines étapes soient adaptées conformément aux directives du fabricant. En outre, un nouveau logiciel Python open-source équipé d’une interface utilisateur graphique conviviale pour l’analyse des données de nanoindentation est présenté, qui permet le criblage des courbes mal acquises, le filtrage des données, le calcul du point de contact par différentes procédures numériques, le calcul conventionnel de E, ainsi qu’une analyse plus avancée particulièrement adaptée aux données de nanoindentation unicellulaire.

Introduction

Le rôle fondamental de la mécanique en biologie est aujourd’hui établi ^1,2. Des tissus entiers aux cellules individuelles, les propriétés mécaniques peuvent renseigner sur l’état physiopathologique du biomatériau étudié ^3,4. Par exemple, le tissu mammaire affecté par le cancer est plus rigide que le tissu sain, un concept qui est à la base du test de palpation populaire⁵. Il a notamment été récemment démontré que la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) causée par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2....

Protocole

1. Préparation des substrats/cellules pour les mesures de nanoindentation

1. Suivez les étapes indiquées dans le Protocole additionnel pour la préparation des hydrogels/cellules PAAm pour les expériences de nanoindentation. La procédure est résumée à la figure 2.
   NOTE: Les hydrogels PAAm ont été choisis car ce sont les hydrogels les plus couramment utilisés dans le domaine de la mécanobiologie. Cependant, le protocole est également applicable à tout type d’hydrogel²⁵ (voir Discussion, modifications de la méthode).

2....

Résultats

En suivant le protocole, un ensemble de courbes F-z est obtenu. L’ensemble de données contiendra très probablement de bonnes courbes et des courbes à écarter avant de poursuivre l’analyse. En général, les courbes doivent être écartées si leur forme est différente de celle de la figure 4A. La figure 5AI montre un ensemble de données de ~100 courbes obtenues sur un hydrogel PAAm mou de E 0,8 KPa³⁵ attendu t?.......

Discussion

Ce protocole montre comment acquérir de manière robuste des données de nanoindentation par spectroscopie de force à l’aide d’un nanopénétrateur de virole disponible dans le commerce sur des hydrogels et des cellules individuelles. En outre, des instructions pour l’utilisation d’un logiciel open-source programmé en Python comprenant un flux de travail précis pour l’analyse des données de nanoindentation sont fournies.

Étapes critiques du protocole
Les ét.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 mm coverslips	VWR	631-1577P
35 mm cell treated culture dishes	Greiner CELLSTAR	627160
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
Acrylsilane	Alfa Aesar	L16400
Ammonium Persulfate	Merk	7727-54-0
Bisacrylamide	Merk	110-26-9
Chiaro nanoindenter	Optics 11 Life		no catologue number
Ethanol			general
Fetal bovine serum	Gibco	16140071
High glucose DMEM	Gibco	11995065
Isopropanol			general
Kimwipe	Kimberly Clark	21905-026
Microscope glass slides	VWR	631-1550P
MilliQ system	Merk Millipore	ZR0Q008WW
OP1550 Interferometer	Optics11 Life		no catalogue number
Optics 11 Life probe (k = 0.02-0.005 N/m, R = 3-3.5 um)	Optics 11 Life		no catologue number
Optics 11 Life probe (k = 0.46-0.5 N/m, R = 50-55 um)	Optics 11 Life		no catologue number
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122
RainX rain repellent	RainX	26012
Standard petri dishes (90 mm)	Thermo Scientific	101RTIRR
Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	110-18-9
Vaccum dessicator	Thermo Scientific	531-0250
Software
Data acquisition software (v 3.4.1)	Optics 11 Life
GitHub Desktop (Optional)	Microsoft
Python 3	Python Software Foundation
Visual Studio Code (Optional)	Microsoft