Name: inducible and reversible dominant-negative (dn) protein inhibition
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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PCS2 + CB Myc6 ベクトルだったマーシャル ・ ホロウィッツ (ワシントン大学, シアトル、ワシントン州、米国) からの贈り物。丙 OC1 セルは、Fedrico Kalinec (デイヴィッド ・ ゲフィン医学カリフォルニア大学ロサンゼルス校、ロサンゼルス、カリフォルニア、米国) によって提供された親切。テクニカル サポートは、UNMC マウスのゲノム工学中心 (C.B. Gurumurthy、ドンは害を与える、・ ローレン クアドロス)、クレイトン大学統合医学イメージング施設 (リチャード ・ Hallworth、ジョン ・ Billheimer) によって提供されました。番号 P20 GM103471 を付与 UNMC マウスのゲノム工学の NIH/日の出から機関の開発賞 (アイデア) 支えられました。統合生体イメージング施設は、クレイトン大学医学部医学科 GM103427 と NIH/日の出から GM110768 の補助金によって支えられました。研究資源 (RR016469) センターからの助成金からの支援で建設された施設と日の出 (GM103427)。本研究では生成されたマウスの行は、クレイトン大学動物資源機能、NIH/NCRR/G20RR024001 での助成金による向上とその経済基盤で維持されました。この作品は、過去の NIH/NCRR/5P20RR018788-/NIH/日の出 8P20GM103471 COBRE 付与 (シェリー d. スミス) に、NIH/ORIP R21OD019745 01A1 (滿 s.)、および (S. Tarang) に公聴会健康づくり財団から新興の研究助成による支援を受けた。本研究の内容は著者の責任し、国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。

トランスジェニック マウスの CBRb の動物の世話と研究に関連する実験のすべての世代はクレイトン大学施設動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) により承認され、彼らのガイドラインによって実行されます。
1. 遺伝子組換え CB Myc6-Rb1 コンストラクト
注:CBRb の pTet_Splice のベクトルへのクローニングは、複数の手順 (図 1...

<ol>
	<li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+MyoD+homodimer+formation+demonstrated+by+a+general+method+of+dominant+negative+mutation+employing+fusion+with+a+lysosomal+protease.">Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease.</a> Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).</li><li>Tarang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+retinoblastoma+(rb)1-inducible+dominant-negative+(DN)+mouse+model.">Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model.</a> Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).</li><li>Kominami, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selective+role+of+cathepsins+B+and+D+in+the+lysosomal+degradation+of+endogenous+and+exogenous+proteins.">The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins.</a> FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).</li><li>Cortellino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+ciliogenesis,+embryonic+lethality+and+severe+impairment+of+the+sonic+hedgehog+pathway+caused+by+inactivation+of+the+mouse+complex+A+intraflagellar+transport+gene+Ift122/Wdr10,+partially+overlapping+with+the+DNA+repair+gene+Med1/Mbd4.">Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4.</a> Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).</li><li>Ferreira, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryonic+lethality+of+H+ferritin+gene+deletion+in+mice.">Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).</li><li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+deficient+for+rb+are+nonviable+and+show+defects+in+neurogenesis+and+haematopoiesis.">Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis.</a> Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).</li><li>Turlo, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+cre-mediated+recombination+in+mice+does+not+result+in+protein+loss.">When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss.</a> Genetics. 186 (3), 959-967 (2010).</li><li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells.">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+knockout+mouse+model+of+retinoblastoma.">The first knockout mouse model of retinoblastoma.</a> Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletions+of+retinoblastoma+1+(Rb1)+and+its+repressing+target+S+phase+kinase-associated+protein+2+(Skp2)+are+synthetic+lethal+in+mouse+embryogenesis.">Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).</li><li>Yamasaki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+E2F-1+reduces+tumorigenesis+and+extends+the+lifespan+of+Rb1(+/-)+mice.">Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice.</a> Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).</li><li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+dominant+negative+retinoblastoma+protein+(RB)+inhibiting+satellite+myoblast+differentiation+implies+an+indirect+interaction+between+MyoD+and+RB.">Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).</li><li>Pitkanen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+human+retinoblastoma+gene+product+in+mouse+fibroblasts:+Effects+on+cell+proliferation+and+susceptibility+to+transformation.">Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation.</a> Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).</li><li>Chano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+abundance+of+RB1CC1+contributes+to+the+non-proliferating+enlarged+cell+phenotype+through+both+RB1+maintenance+and+TSC1+degradation.">Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).</li><li>Kole, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+therapeutics:+Beyond+RNA+interference+and+antisense+oligonucleotides.">RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).</li><li>Yamamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ons+and+offs+of+inducible+transgenic+technology:+A+review.">The ons and offs of inducible transgenic technology: A review.</a> Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).</li><li>Houdebine, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animal+models+in+biomedical+research.">Transgenic animal models in biomedical research.</a> Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).</li><li>Brehm, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoblastoma+protein+recruits+histone+deacetylase+to+repress+transcription.">Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription.</a> Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2F-HDAC+complexes+negatively+regulate+the+tumor+suppressor+gene+ARHI+in+breast+cancer.">E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer.</a> Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).</li><li>Magnaghi-Jaulin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoblastoma+protein+represses+transcription+by+recruiting+a+histone+deacetylase.">Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase.</a> Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).</li></ol>

伝統的な形質転換戦略に関連付けられている制限を回避するために我々 は内因性ポイを時空間的にそれの DN の変異形を ⓫ 条件付きで不活性化することができますマウス モデルを生成しようと思う。内因性のランドマークの機能を廃止するには、いくつかのオプションは、15,,16,17をされています。式の表現に影響を与え?...

遺伝子および蛋白質の試練を目指すほとんどのアプローチは、一般的に完全な除去や遺伝子、rna、または興味 (POI) の蛋白質の切り捨てにつながる永続的なプロセスに依存します。このメソッドの全体的な目標は、内因性、野生型タンパク質の機能を廃止する組換え蛋白質をエンジニア リングすることです。再訪し、DN の抑制を介してポイの一時的なアブレーションは、代替戦略1,2を刷新しました。このメソッドは、ポリコームタンパクと単量体ペプチドの両方のために働くが、ポリコームタンパク アセンブリ内で機能する蛋白質に最適です。
メソッドは、溶断ポリコームタンパク ポイ (CB 融合タンパク複合体) のサブユニットにライソゾーム プロテアーゼ CB で構成されます。複雑な結果の CB の融合との対話し生内因性のタンパク質を消化したり劣化3リソソームに全体の CB-POI の複合体をそらします。また、テトラサイクリン制御転写活性化 (重音テト) 系の誘導の自然と、CB 融合タンパク複合体の組み合わせは、リバーシブル ファッション2遺伝子の誘導と制御式にできます。多くの状況で有用遺伝子または蛋白質の生体内での完全な削除は致死率4,5,6で起因できます。同様に、それは最終的には、重要なゲノムの要素7の永久的な損失につながるのいくつかの遺伝子または蛋白質 Cre/Lox システムを使用して組織に固有の条件付きの削除は簡単にできません。したがって、遺伝子や POI によってこれらのアプローチのどちらも有効であるその後の研究のための有用なモデルを提供する特に遺伝子または蛋白質の後半の産後と大人のマウスの機能の研究。
提案手法の有効性に関する証拠の原則そのようなアプローチに関連する問題を回避し、提供、我々 は網膜芽細胞腫 1 (RB1) 蛋白質の条件付き DN バージョンを生成することによって、ここで紹介する方法をテストする分野します。いくつかのオプションは、内因性 RB1 の機能を廃止する提案8,9,10をされています。しかし、それらのすべての上記で説明した同じ制限に直面: RB1 の永久的な生殖削除は強肩致死、その腫瘍サプレッサーの役割と永続的な一貫性のある RB1 条件付き削除へとつながって様々 な腫瘍11。にもかかわらず、RB1 の DN バージョンは、自然に発生するとは思えない、現在利用可能な戦略をより良い代替手段が内因性の RB1 の一時的に制御された不活性化を可能にする、最終的に復元する別のメカニズムを提供する、関数。そのような構築のための基礎は前に二十年以上に述べた1。ただし、技術的な制限のためには組織特異性、応答制御遺伝子の活性化機構を欠けていた。本研究ではドキシサイクリン (Dox) の優雅を結合する最初のライソゾーム プロテアーゼ CB とRb1蛋白質の組み換え遺伝子組換えコンストラクト依存転写システム。結果の CBRb マウス モデルは、一時的に規制 Dox を介した RB1 規制2。プロテオーム ベースのアプローチを使用して遺伝子の働きを研究するの利点は、それがその活動を最小限の情報で関心の任意の遺伝子が採用されることがあります。
DN 遺伝子手法では、従来の方法に比べて多くの利点を提供しています。まず、DN タンパク質阻害は蛋白質の活動、したがって残留内因性表現を維持にのみ部分的なアブレーションに します。そのような結果は蛋白質の活動の完全な除去が胚性致死率は、大きく生きているマウスの遺伝子の機能を研究する任意の調査を制限することにつながるような状況で非常に望ましい。第二に、重音テト システムの存在は、遺伝子活動の効率的かつ可逆的な制御が可能の抗生物質の存在下でのみ遺伝子活性化できます。したがって、抗菌薬の投与を中止、形質転換システムは非アクティブにできますと通常の RB1 式は元の場所に。第三に、導入遺伝子発現の特異性は、任意のプロモーターによって異なります。原理実証のためのユビキタス ローザ CAG プロモーターをいただいて、組織固有のプロモーター遺伝子を配置することは不要な遺伝子発現を制限し、この遺伝子治療への応用に関する研究を促進する可能性が高い方法論。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:768px;" width="769">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:255px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium, DMEM</td>
			<td style="width:228px;">GIBCO-BRL</td>
			<td style="width:119px;">11965-084</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Minimum Essential Medium Eagle, MEME&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">M8042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F2442&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Lipofectamine&#160;</td>
			<td style="width:228px;">DharmaFECT</td>
			<td style="width:119px;">T-2010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sal I</td>
			<td style="width:228px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11745622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EcoRV-HF</td>
			<td style="width:228px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">NotI</td>
			<td style="width:228px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">13090730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CaspaTag&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">APT523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">DAPI</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Staurosporine</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CyQuant NF cell proliferation kit&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C35007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Retinoblastoma 1 antibody</td>
			<td style="width:228px;">Abcam</td>
			<td>Ab6075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">c-Myc antibody</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td>M5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">b-actin</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A5316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ki-67&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">MA5-14520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phallodin</td>
			<td style="width:228px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence microplate reader</td>
			<td style="width:228px;">FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Epifluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:228px;">NikonEclipse80i</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:601px;">The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible and reversible dominant-negative (dn) protein inhibition

ドミナント ネガティブ (DN) タンパク質阻害タンパク質の機能を操作するための強力な方法は、他のゲノム情報に基づくアプローチに比べていくつかの利点を提供しています。たとえば、キメラがCre LoxPターゲット戦略が広く使用されている、(すなわち、漏れのプロモーター活性、モザイクCre式等)、これらの戦略の本質的な制限は制限が大幅にアプリケーション。また、多くの内在性遺伝子の完全な削除、強肩致命的、生後の遺伝子機能を研究することは不可能です。これらの課題に対処するため我々 は初期遺伝子工学プロトコルを大幅に変更し、ライソゾーム プロテアーゼの Rb1 遺伝子の短い (遺伝子組換え) バージョンの併用 procathepsin B (CB)、Rb1 の DN マウス モデルを生成する (CBRb)。ライソゾーム プロテアーゼの存在のために全体の CB RB1 融合タンパク質およびその相互作用の複合体はプロテアソームを介した分解にルーティングされます。また、遺伝子導入構成体のテトラサイクリン誘導 (情報を頼むこと) 要素の存在により RB1 蛋白質の誘導性かつ可逆的な規制です。CBRb マウス モデルにおけるユビキタス ローザ CAG プロモーターの存在はそれに一時的の Rb1 遺伝子アブレーションを実施し、研究者に事実上任意のセル型での活動を理解するためのリソースを提供する便利なツール、RB1 が表されます。

一般的には、DN の突然変異を設計するには、大量の構造に関する情報と POI の機能が必要です。対照的に、POI の構造と機能情報が限られた場合、ここに示す DN 戦略は特に役立ちます。ライソゾーム プロテアーゼに 1 つのサブユニットの融合支配的組み立て多量体と、潜在的に、内因性サブユニットのタンパク質分解との細胞の転換の組み合わせにより他の配位子を?...

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Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

ここで任意のタンパク質をそれのドミナント ネガティブ変異体バージョンを元に戻せる状態 ⓫ 条件付きで不活性化することができます、ドミナント ネガティブ誘導システムを開発するためのプロトコルを提案する.

誘導およびリバーシブルのドミナント ネガティブ (DN) 蛋白質の阻害

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

この方法は、支配的な陰性バージョンを可逆的に過剰に発現させることによって、関心のある遺伝子の条件付きおよび一過性不活性化を必要とする多種多様な分野の主要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、タンパク質活性の部分的なアブレーションのみを可能にし、したがって、残留内因性発現を維持する点である。しかし、ここで多量体集合体で機能するRBタンパク質の不活性化状態について述べ、この方法論は単量体タンパク質にも適用できる。ウメシュ・ピャクレル、私たちの研究室の技術者と原稿の共著者は、手順を示します。まず、NIH3T3細胞を成長させます, ベンダーの仕様に従って, 摂氏37度で 5%CO2, 10%牛血清を含む推奨細胞培地を使用して.pTet-SpliceおよびpCMV-Tet3Gベクターを用いて細胞をコトランスフェクトするには、まず15ミリリットルチューブで脂質ベースのトランスフェクション試薬を2~4マイクロリットル、15ミリリットルチューブで1リットルの不完全なDMEMを1ml混合し、室温で5分間インキュベートする。このトランスフェクション試薬のDMEMミックスに、井戸当たり2~3マイクログラムの血漿DNAを追加します。室温で20分間混ぜ合わせてインキュベートします。DNAとトランスフェクション試薬を含む混合物を、NIH3T3細胞を有する6ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットル添加する。5%CO2で摂氏37度で3〜4時間のインキュベーションを行った後、完全な培地を1ミリリットル加えます。次に、各ウェルに2マイクロリットルのドキシサイクリンストックを加え、プレートをプラスドキシサイクリンとしてマークします。5%CO2で37°Cで細胞をインキュベートします。予定外の細胞増殖を促進する上でのTetO-DN-CB-myc6-Rb1構築物の機能性を評価するために、10%FBSを含有するDMEM中の培養HEI-OC1細胞を、寛容な条件下で行った。細胞増殖試験では、細胞カウンターを用いてHEI-OC1細胞を数える。プレート 10,000 HEI OC1 細胞は、それぞれ 200 マイクロリットルの体積で 96 ウェル プレート上のウェルあたり。5%CO2で摂氏33度で一晩で細胞をインキュベートします。トランスジーン発現を誘導するには、トランスフェクトしたHEI-OC1細胞のサブセットに、ドキシサイクリンのミリリットル当たり1マイクログラムを加える。マイナスドキシサイクリンと非トランスフェクトHEI-OC1細胞としてラベル付けされた他のサブセットをコントロールとして使用し、細胞を10%CO2で摂氏33度としてインキュベートします。細胞増殖を評価するために、トランスフェクションの48時間後に、細胞培養培地を取り出し、細胞増殖キットからマイクロプレートの各ウェルに100マイクロリットルの100マイクロリットルの色素結合溶液を加える。メーカーのプロトコルに従い、摂氏37度で1時間インキュベートします。蛍光マイクロプレートリーダーを使用して、各サンプルの蛍光強度を測定します。免疫細胞化学を用いて細胞増殖をさらに評価するには、HEI-OC1細胞をDMEMの12ウェルプレートの各ウェルに置かれたカバーガラスに盛り付けます。セルを摂氏33度で一晩インキュベートします。翌日、pTet-SpliceとpCMV-Tet3Gベクターを用いて2つのウェル内の細胞にコトランスフェクトし、NIH3T3細胞で行われた1つのウェルでドキシサイクリン処理を行います。1 つの未感染をコントロールとして使用します。Ki-67標識用の細胞を処理するには、室温で10分間PBSで4%パラホルムアルデヒドで固定します。その後、氷冷PBSでそれぞれ5分間3回洗います。PBSに0.25%の非イオン洗剤を加え、10分間インキュベートします。PBSで3回、それぞれ5分間洗浄を繰り返します。細胞をブロックするために10%の血清を使用してください。室温で1時間加湿したチャンバーで。Ki-67一次抗体を500マイクロリットル加え、摂氏4度で一晩インキュベートします。細胞を再びPBSで3回、それぞれ5分間洗います。二次抗体を1ミリリットル加え、暗い温度で1時間細胞をインキュベートします。二次抗体溶液を除去した後、再び細胞を暗所のPBSで5分間3回洗浄する。HEI-OC1細胞にファロイジンを標識するには、1:200ファロイジンで室温で30分間インキュベートします。細胞核にラベルを付けるには、DAPIの1ミリリットル当たり5マイクログラムの細胞を室温で10分間インキュベートする。トランスジーンマウスの送達後、原稿に記載されているようにCBRb1融合領域に特異的なプライマーセットを用いて子犬を遺伝子型化する。成体TetO-DN-CB-myc6-Rb1マウスをROSA-CAG-rtTAおよびテトレサイクリン誘導体ラインに繁殖させ、実験DN-CBRbマウスを生成し、原稿に記載されているように子孫を遺伝子型化する。NIH3T3は内因性RB1タンパク質を発現しないため、ここで見られる堅牢なRB1発現は、Doxの存在下でのトランスジーン誘導によるもので、その存在しない場合、TetO-DN-CB-myc6-Rb1ミックスRB1構築物の効率的な活性化を確認する。これに対し、HEK293細胞は内因性RB1発現を有する。ドキシサイクリンの添加により、テト-DN-CB-myc6-Rb1活性化およびRB1ダウンレギュレーションが行なわれます。RB1発現は、ドキシサイクリンを培地から除去した21時間後に再開した。HEI-OC1細胞は同じベクターでコトランスフェクトされ、ドキシサイクリンで処理されていないトランスフェクト細胞と比較してドキシサイクリン治療に続く細胞数の緩やかだが有意な増加を示した、および未感染細胞。蛍光インシンハイブリダイゼーションは、マウスにおけるTetO-DN-CB-myc6-RB1トランスジーンのゲノム挿入を確認した。ドキシサイクリンで治療したトランスジェニックマウスの全RB1タンパク質発現の初期増加は、対照群と比較して3日間であった。しかし、7日間および10日間ドキソサイクリンで治療した群では、RB1発現の有意な低下が観察された。分析した組織に関係なく、ドキソサイクリンで治療されたトランスジェニックマウスではRB1タンパク質の有意な減少が認められたが、対照群では認められず、TetO-DN-CB-myc6-RB1構築物の効率を確認した。この手順を試みる際には、トランスジーンの各コード要素が互いにフレームに入っていることを確認することが重要です。この報告書に記載されているカテプシンBとレチノ芽腫のコード領域が偶然、フレーム外に接続されていた場合、意図した融合タンパク質は得られないだろう。したがって、DNA配列の検証は、トランスジーンを単細胞マウス胚に注入する前に行う必要があります。この手順に従って、ユビキタスCAGプロモーターは、細胞の特異的な方法で遺伝子機能を研究するために特定のプロモーターに置き換えることができる。

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

誘導性T7 RNAポリメラーゼ媒介マルチ遺伝子発現システム、pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

蛍光タンパク質融合物中の生成<em&gt;カンジダ</em&gt;種

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

誘導性一過性トランスフェクションを介して制御可能なイオンチャネルの発現

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

遺伝子編集アメリカナマズ、 Ictalurus イシガキダイ胚に CRISPR/Cas9 蛋白質のマイクロインジェクション

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

流体の尾静脈注射を使用してマウス肝細胞の生体内で遺伝的変更の構成および誘導システム

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

南しみが付くことおよびポリメラーゼの連鎖反応を使用してマウス胚性幹細胞での相同組換えイベントの識別

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

誘導、細胞型における発現シロイヌナズナLhGR を介したトランス-活性化

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

非正規の開いたリーディング ・ フレームから翻訳された蛋白質を発表する OpenProt データベースを利用した質量分析を用いたプロテオミクス解析

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

細菌におけるタンパク質-RNA結合を定量するためのアッセイ

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

ビオチン標識を用いてタンパク質核酸相互作用を研究するインビトロ生化学アッセイ

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

誘導およびリバーシブルのドミナント ネガティブ (DN) 蛋白質の阻害

誘導およびリバーシブルのドミナントネガティブ (DN) 蛋白質の阻害