Name: creation of colonic anastomosis in mice
Uploaded: 2019-01-17T14:00:00
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Il seguente protocollo è stato approvato dalla University of Oklahoma Health Sciences Center istituzionali cura degli animali e uso Committee (IACUC) ed è conforme a tutti gli orientamenti etici istituzionali per quanto riguarda l'uso di animali di ricerca. Inoltre, tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità alle norme istituzionali, statali e federali per quanto riguarda la ricerca sperimentale su animali.
Nota: Per questo protocollo, abbiamo usato Congenici maschili e femmini...

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	<li>Murrell, Z. A., Stamos, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reoperation+for+anastomotic+failure.">Reoperation for anastomotic failure.</a> Clinics in colon and rectal surgery. 19, 213-216 (2006).</li><li>Shaban, F., Carney, K., McGarry, K., Holtham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforated+Diverticulitis:+To+Anastomose+or+Not+to+Anastomose?+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis.">Perforated Diverticulitis: To Anastomose or Not to Anastomose? A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> International journal of surgery (London, England). , (2018).</li><li>Chambers, W. M., Mortensen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postoperative+leakage+and+abscess+formation+after+colorectal+surgery.">Postoperative leakage and abscess formation after colorectal surgery.</a> Best practice, research. Clinical gastroenterology. 18, 865-880 (2004).</li><li>Ashkanani, F., Krukowski, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgery+-+Oxford+International+Edition.">Surgery - Oxford International Edition.</a> Intestinal Anastomosis. 20, 104-107 (2002).</li><li>Raptis, D., Pramateftakis, M. G., Kanellos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Our+20-year+experience+with+experimental+colonic+anastomotic+healing.">Our 20-year experience with experimental colonic anastomotic healing.</a> Journal of medicine and life. 11, 5-14 (2018).</li><li>Pommergaard, H. C., Rosenberg, J., Schumacher-Petersen, C., Achiam, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+the+best+animal+species+to+mimic+clinical+colon+anastomotic+leakage+in+humans:+a+qualitative+systematic+review.">Choosing the best animal species to mimic clinical colon anastomotic leakage in humans: a qualitative systematic review.</a> European surgical research. Europaische chirurgische Forschung. Recherches chirurgicales europeennes. 47, 173-181 (2011).</li><li>Komen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+anastomotic+leakage:+a+new+experimental+model.">Colorectal anastomotic leakage: a new experimental model.</a> The Journal of surgical research. 155, 7-12 (2009).</li><li>Perry, T., Borowiec, A., Dicken, B., Fedorak, R., Madsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+ileocolic+bowel+resection+with+primary+anastomosis.">Murine ileocolic bowel resection with primary anastomosis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e52106 (2014).</li><li>Pommergaard, H. C., Achiam, M. P., Rosenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colon+anastomotic+leakage:+improving+the+mouse+model.">Colon anastomotic leakage: improving the mouse model.</a> Surgery today. 44, 933-939 (2014).</li><li>Bosmans, J. W. A. M., Jongen, A. C. H. M., Bouvy, N. D., Derikx, J. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+anastomotic+healing:+why+the+biological+processes+that+lead+to+anastomotic+leakage+should+be+revealed+prior+to+conducting+intervention+studies.">Colorectal anastomotic healing: why the biological processes that lead to anastomotic leakage should be revealed prior to conducting intervention studies.</a> BMC Gastroenterology. 15, 180 (2015).</li></ol>

Ci sono diversi passaggi chiave per garantire il successo di e ridurre al minimo la morbilità/mortalità connessa con questa procedura. In primo luogo, garantire la gestione attenta del tessuto intestinale e fare attenzione a evitare lesioni di trazione durante la rotazione i visceri per esporre i due punti. Indebita tensione dell'intestino o mesentere possibile ferita la necrosi intestinale intestinale o il sistema vascolare e causa lontano dal sito dell'anastomosi. Inoltre, pinze taglienti o forcipe con denti non deve...

Una complicazione altamente temuta di anastomosi chirurgica dell'intestino è anastomotic guasto o perdita. Perdita anastomotic, che provoca la fuoriuscita del contenuto intraluminale nella cavità addominale, è pericolosa e può rapidamente portare a sepsi intra-addominale; prezzo shock varia dallo 0,3% al 5,5% seguendo le anastomosi dell'intestino tenue e salire a tra 0,5% e 26% per anastomosi colica1,2. Tassi di mortalità dopo perdite possono essere alti come 39% a causa della rapida insorgenza di sepsi e progressione veloce a morte dopo contaminazione intra-addominale3. Strategie preventive e modalità di trattamento sono attualmente basate su patofisiologia che completamente non è capito.
Attualmente, guarigione anastomotic è spesso paragonata alla guarigione della ferita cutanea più ampiamente studiati, che sta dimostrando di essere un facsimile relativamente povero. La guarigione si verifica in una serie di fasi sovrapposte, a partire dalla fase iniziale del ritardo. Durante i giorni 0-4 dopo la creazione dell'anastomosi intestinale, la fase di ritardo è definita da una risposta infiammatoria acuta che cancella la ferita di detriti cellulari. Successivamente, nei giorni 3-4, produzione di collagene e proliferazione fibroblastica caratterizza la fase di fibrophasia. Infine, dopo 10 giorni, un periodo prolungato di rimodellamento del collagene è conosciuto come la fase di maturazione. È importante notare che forza anastomotic è piuttosto bassa e dipende dal sostegno estrinseco delle graffette chirurgicamente posizionati o suturare fino a quando il collagene è depositato4. Comprensione del ruolo e tempistica ogni strato della parete intestinale svolge nella cicatrizzazione anastomotica e il coinvolgimento in tipi di cellule infiammatorie-mediata come macrofagi, nonché illuminante markers surrogati per predire guasto anastomotic o successo potrebbe ridurre notevolmente la morbilità, la mortalità e la spesa sanitaria seguendo colon operazioni5.
Il modello murino è stato indicato negli studi precedenti l'utile in che imita l'anastomosi umano6. Mentre ci sono esempi popolari, provati e ben studiati il modello murino di anastomosi colica, particolarmente il metodo descritto da Komen et al. 7, questi modelli favoriscono ileocecale o ascendente colocolonic anastomotico tecniche8. Gli studi precedenti dei pazienti umani hanno dimostrato significative differenze nei tassi di perdita ileocecal, colocolonic e anastomosi colorettale, evidenziando la necessità di ulteriori modelli sperimentali a diverse posizioni anatomiche. Ulteriori metodi comunemente utilizzati sono finalizzati allo sviluppo di un modello che crea volutamente una perdita anastomotic anziché delucidare i meccanismi cellulari necessari per la normale cicatrizzazione anastomotica di9. Modelli del ratto sono state tentate in passato ma hanno tassi di deiscenza anastomotica e/o segni di perdita (cioè, la formazione di ascesso) significativamente più bassa di esseri umani e topi6,7. Inoltre, sono disponibili in topi che i ratti più geneticamente linee sperimentali. Questo rende meno utile per un modello anastomotic modello del ratto. Inoltre, suini e canini modelli hanno avuto meno clinico indagine rispetto al modello murino6,7.
Vi proponiamo una procedura sicura, tecnicamente semplice e rapidamente e facilmente riproducibile per la creazione di anastomosi coliche in un modello murino che dovrebbero facilitare l'indagine successiva nel meccanismo underreported della ferita anastomotic guarigione10 .

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	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL6/J mice</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>#00664&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Absorbent Underpads, 20&#34; x 24&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-206-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylined Sterile Field, 18&#34; x 24&#34;</td>
			<td>Busse Hospital Disposables</td>
			<td>696</td>
			<td>Cut a rectangular hole&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia isoflurane</td>
			<td>Henry Schein&#160;</td>
			<td>50033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4&#34; x 4&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-415-469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube</td>
			<td>Dechra Veterinary Products</td>
			<td>NDC 17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair depilatory cream</td>
			<td>Church &#38; Dwight Co.</td>
			<td>22339-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenex buprenorphine&#160; 0.3 mg/ml</td>
			<td>Reckitt Benckiser Pharma Inc</td>
			<td>NDC 12496-0757-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 cc insulin syringe, 27&#160;G</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>329412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloraprep Shampoo</td>
			<td>Medline</td>
			<td>APL82287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Webcol alcohol prep swabs</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioGel PI surgical gloves</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care</td>
			<td>ALA42675Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forceps with teeth</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors- sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight serrated forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11050-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castro-Viejo needle driver</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12565-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Irrigation</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>BHL2F7121</td>
			<td>Warm to 37 &#176;C prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Vicryl absorbable braided suture, 18&#34;, PS-2 needle</td>
			<td>Henry Schein&#160;</td>
			<td>6546037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue monofilament suture 24&#8221; BV-1 needle</td>
			<td>Henry Schein&#160;</td>
			<td>8305H</td>
			<td>Usually comes double-armed. Cut the suture at the midway point to generate two usable sutures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cole-Parmer Microscissors, Standard Grade, Straight, 4&#34;.</td>
			<td>Cole- Parmer</td>
			<td>EW-10818-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medline Sterile lubricating jelly</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MDS032273H</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creation of colonic anastomosis in mice

Anastomosi intestinale vengono comunemente eseguite in operazioni emergenti ed elettive. Anche così, perdite anastomotiche sono un altamente temute complicanze della chirurgia colica e possono accadere in fino a 26% delle anastomosi chirurgiche, con mortalità essendo fino al 39% per i pazienti con una perdita di tale. Attualmente, ci rimane una scarsità dei dati dettagliare i meccanismi cellulari di guarigione anastomotiche. Mettendo a punto strategie preventive e le modalità di trattamento per perdita anastomotic potrebbe essere notevolmente rafforzato da una migliore comprensione di guarigione anastomotic appropriato.
Un modello murino è ideale in quanto gli studi precedenti hanno dimostrato che l'anastomosi murino è il più clinicamente simile al caso umano rispetto ad altri modelli animali. Offriamo un modello murino facilmente riproducibile dell'anastomosi colica in topi che permetterà per ulteriore illustrazione di guarigione anastomotiche.

A 7 giorni dopo la chirurgia, l'anastomosi deve essere ben guarito. L'anastomosi può essere raccolto a intervalli di tempo prima e dopo sette giorni per meglio illustrare le fasi di guarigione anastomotiche. Nella Figura 9, l'analisi istologica mostra un fibrotico (collagene visualizzato tramite la colorazione tricromica) risposta mediata dai miofibroblasti positivi di alfa-actina del muscolo liscio. Tuttavia, abbiamo trovato che i risultati dalle analisi is...

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Creation of Colonic Anastomosis in Mice

Perdita anastomotic o ripartizione dopo la chirurgia è delle principali cause di mortalità e di morbosità postoperatoria. Il nostro studio per la creazione di un'anastomosi colica è un metodo affidabile e riproducibile per studiare i meccanismi di guarigione delle anastomosi.

Creazione dell'anastomosi colica in topi

Intestinal anastomoses are commonly performed in both elective and emergent operations. Even so, anastomotic leaks are a highly feared complications of ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sui meccanismi di guarigione delle anastomosi colo-coloniche e può fornire un modello per ridurre i tassi di perdite anastomotiche e le loro conseguenze potenzialmente devastanti. La nostra tecnica offre un metodo relativamente semplice e riproducibile per eseguire anastomosi colo-colonica o colo-rettale in un modello animale con tassi di perdita clinica simili a quello dei pazienti umani. Inizia fissando gli arti di un topo anestetizzato sulla superficie chirurgica e disinfettando l'addome esposto con clorexidina.Quindi posiziona un drappo sterile sull'animale e fai un'incisione della pelle lungo la linea mediana dell'addome inferiore fino allo xifoide. Utilizzare le forcep per sollevare la linea mediana della parete addominale e fare attenzione a non ferire le strutture intra-addominali per incidere la lunghezza della fascia addominale della linea mediana. Quando l'intestino è esposto, localizzare il cieco e l'intestino piccolo e ruotare medialmente i visceri laterali sinistro per esporre il colon discendente e sigmoide.Quindi coprire i visceri con garza umida e sterile. Rivestire una punta della sonda smussata con gelatina lubrificante e far avanzare attentamente la sonda nel retto per aiutare l'identificazione del colon sigmoideo discendente. Una volta identificato il colon, ritirare parzialmente la sonda e utilizzare le forcep atraumatiche per afferrare delicatamente il colon sigmoide superiore all'ingresso pelvico.Usando micro forbici affilate, fare un taglio lungo il colon sigmoideo, perpendicolare al tessuto intestinale, e che si estende dall'80 al 90% su tutta la larghezza del colon. Se un vaso sanguigno mesenterico viene ferito durante il corso della rotazione viscerale o della colotomia, applicare delicatamente pressione alla vista della lesione per un massimo di due minuti. Per riparare la colotomia sigmoide, utilizzare un driver dell'ago castroviejo e da cinque a sei semplici punti in polipropilene non assorbibili interrotti per riparare la colostomia.Eseguire l'anastomosi al confine mesentere e raggiungere bilateralmente il confine anti-mesentere aiuta a garantire un brevetto e un'anastomosi non stenosi. Man mano che la riparazione progredisce, far avanzare la sonda di dissezione anale e smussata per coprire la riparazione prima che le suture iniziali siano posizionate per aiutare a prevenire una riparazione troppo stretta e per ridurre i tassi di rigore anastomotico. Quando tutte le suture sono state posizionate, utilizzare una siringa da 10 millilitri riempita con soluzione salina sterile riscaldata per irrigare l'addome più volte.Durante l'irrigazione finale riempire l'addome con soluzione salina sterile e avanzare con cura un angiocatetere lubrificato da 18 gage nel retto per gonfiare il colon con 5-un centimetro cubo d'aria, per l'identificazione di una perdita all'interno dell'anastomosi. Quindi posizionare una sutura aggiuntiva per la riparazione e gonfiare nuovamente i due punti per assicurarsi che non ci siano perdite. Sgonfiare il colon con l'angiocatetere prima della rimozione e riportare delicatamente i visceri medializzati alla sua normale posizione anatomica.Utilizzare quattro suture intrecciate assorbibili O per chiudere l'incisione addominale, con una sutura di corsa lungo lo strato muscolare della parete addominale, a partire dalla parte superiore dell'incisione e finendo all'aspetto inferiore dell'incisione. Quindi utilizzare una sutura monofilamento a quattro O per chiudere la pelle e monitorare il mouse fino a quando non si è completamente ripreso dall'anestesia. Nel punto finale sperimentale appropriato, sterilizzare l'addome con clorexidina e 70% di etanolo e utilizzare forbici affilate per re-incidere l'incisione mediana originale.Utilizzare le forbici per tagliare lo strato muscolare ed eseguire attentamente una rotazione viscerale mediale sinistra per esporre il colon sigmoide riparato. Identificare la vista di riparazione individuando le code della sutura in polipropilene utilizzata per la riparazione. Sezionare delicatamente e senza mezzi termini qualsiasi intestino alle aderenze intestinali lontano dalla vista della riparazione, facendo attenzione a non interrompere l'anastomosi.Utilizzare una penna di marcatura per delimitare il bordo antimesenterico dei due punti, prima della rimozione del segmento dei due punti. Successivamente, usa le forbici per trasversalmente traslict attraverso il colon discendente, a un centimetro dalla coppia, fino a un centimetro distale dalla vista dell'anastomosi. I tessuti post operatori tendono ad essere estremamente fragili e gli anelli chirurgici, nonché una manipolazione delicata e meticolosa dei tessuti, aiutano a garantire contro l'interruzione dell'anastomosi chirurgica.Utilizzare forbici fini per sezionare bruscamente il colon dal mesenterio attaccato lungo il bordo posteriore dei due punti per rimuovere il segmento sigmoidale. E tagliare lungo la lunghezza del bordo mesenterico in modo longitudinale, per creare una sezione rettangolare di due punti dall'esemplare cilindrico precedentemente rimosso. E fare un taglio longitudinale lungo la lunghezza del colon, di fronte alla marcatura.Quindi fissare, imbed e tagliare il tessuto campione se necessario per l'istologia e o l'immunosocienza. L'analisi istologica, sette giorni dopo l'infortunio, rivela una risposta di guarigione fibrotica, mediata da miofibroblasti positivi agli alfa muscolari lisci. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di eseguire un test di insufflazione con l'anastomosi sommersa sotto la normale soluzione salina, di confermare la persistenza dell'anastomosi e di assicurarsi che non sia presente alcuna perdita.Questa procedura può essere eseguita su topi geneticamente modificati o patogeni con disturbi della guarigione delle ferite, come topi diabetici o immunopressi, per rispondere a domande aggiuntive sui fattori che contribuiscono a una perdita anastomotica. Seguendo questa procedura, l'immunoistochimica e la coltura cellulare possono essere eseguite da tessuto anastomotico raccolto in specifici punti di tempo dopo l'intervento chirurgico, per fornire una migliore comprensione delle cellule coinvolte e del loro ruolo nel processo di guarigione anastomotica. Non dimenticare che lavorare con Isoflurane può essere estremamente pericoloso e che le precauzioni, come l'uso di cappe di filtrazione e ventilazione del carbonio, dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.

Research

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