Questi saggi possono aiutare a chiarire il ruolo dei residui di triptofano nelle proteine durante l'esecuzione di studi di legame ANS. La fluorescenza ANS aumenta quando si lega a specifici siti strutturali nelle proteine. A volte il sito di legame ANS si trova vicino a un residuo di triptofano con una distanza che suggerisce l'esistenza di FRET tra il triptofano e l'ANS.
NBS media la modifica chimica dei residui di triptofano nelle proteine, estinguendone la fluorescenza. Pertanto, questi saggi consentono di determinare se i residui di triptofano contribuiscono all'aumento dell'intensità di fluorescenza ANS da parte di FRET. In questo lavoro, utilizziamo un dominio di legame nucleotidico ricombinante ingegnerizzato da SERCA contenente mutazioni, con l'obiettivo di localizzare un triptofano vicino al sito di legame nucleotidico in cui si lega anche ANS.
Questo test è rapido e facile da eseguire, da qui il suo principale vantaggio. Determinazione in silico dell'interazione ANS e SERCA N-Domain. Generare una struttura tridimensionale della proteina mediante modellazione molecolare utilizzando il software di modellazione proteica preferito.
Identificare i residui di amminoacidi che formano il sito di legame nucleotidico utilizzando il software strutturale molecolare preferito e determinare la presenza di residui di arginina e lisina. Questi sono necessari per il legame ANS e aumentano l'intensità della fluorescenza. A causa della presenza di residui di arginina e lisina nel sito di legame nucleotidico di SERCA, ipotizziamo il legame di ANS al dominio N.
Nel modello 3D, i residui di amminoacidi che formano il sito di legame dell'ATP sono identificati ed evidenziati in arancione. Allo stesso modo, la mutazione tirosina-triptofano si trova ed evidenziata in blu. Eseguire l'attracco molecolare con ATP, FITC e ANS.
I risultati dell'attracco mostrano che ANS si adatta bene al sito di legame nucleotidico, in modo simile ad ATP e FITC. FITC etichetta il sito di legame nucleotidico. Calcolare la distanza molecolare tra il residuo di triptofano e ANS.
20 angstrom sembra essere una distanza adeguata per FRET. Eseguire la simulazione dinamica molecolare del complesso ANS N-Domain per determinare la stabilità dell'interazione. Un tempo di simulazione di 10 nanosecondi mostra la stabilità del complesso.
Procedere all'esecuzione degli esperimenti in vitro. Espressione e purificazione del dominio N ricombinante. Esprimere e purificare, per cromatografia di affinità, il dominio N ricombinante ingegnerizzato.
Eseguire una SDS-PAGE della proteina purificata per determinarne la purezza. Determinare la concentrazione proteica per assorbanza a una lunghezza d'onda di 280 nanometri con il coefficiente di estinzione del dominio N. Monitorare la formazione del complesso ANS N-Domain in base alle variazioni di intensità di fluorescenza ANS e N-Domain.
Preparare una soluzione stock ANS in N, N-dimetilformammide. Pesare una piccola quantità di ANS, tra uno e cinque milligrammi. Sciogliere ANS in un mL di volume finale di N, N-dimetilformammide.
Preparare una soluzione stock ANS da 100 micromolari utilizzando la soluzione ANS in N, N-dimetilformammide. Mescolare la soluzione vorticosamente da tre a cinque volte. Preparare la soluzione stock NBS in N, N-dimetilformammide.
Pesare una piccola quantità di NBS, da uno a cinque milligrammi. Sciogliere l'NBS in un mL di N, N-dimetilformammide. Preparare una soluzione stock NBS mono millimolare utilizzando la soluzione NBS in N, N-dimetilformammide.
Mescolare la soluzione vorticosamente da tre a cinque volte. Titolare il dominio N con ANS e registrare gli spettri di fluorescenza per l'eccitazione ad una lunghezza d'onda di 295 nanometri a 25 gradi. Ottenere la linea di base dello spettro di fluorescenza.
Posizionare un mL di tampone fosfato 50 millimolare con pH otto in una cuvetta di quarzo a fluorescenza da un mL. Posizionare la cella nella camera cellulare termostatata dello spettrofotometro e impostare la lunghezza d'onda di eccitazione su 295 nanometri. Registrare lo spettro di fluorescenza.
Lo spettro di fluorescenza del bianco mostra il picco dell'acqua, che deve essere sottratto in seguito. Ottenere lo spettro di fluorescenza intrinseco del dominio N. Posizionare 900 microlitri di tampone fosfato millimolare con pH 8 in una cuvetta di quarzo a fluorescenza.
Aggiungere 100 microlitri di sospensione N-Domain per ottenere una concentrazione finale di N-Domain micromolare. Omogeneizzare delicatamente utilizzando una micropipetta per garantire l'omogeneità della soluzione. Posizionare la cella nella camera termostatata dello spettrofotometro.
Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione su 295 nanometri. Registrare lo spettro di fluorescenza intrinseca N-Domain. Aggiungi ANS e ottieni lo spettro di fluorescenza per eccitazione ad una lunghezza d'onda di 295 nanometri.
Aggiungere un'aliquota di due microlitri di 100 micromolari ANS soluzione stock al dominio N sospeso per ottenere una concentrazione finale di ANS micromolare di 0,2 micromolari. Omogeneizzare delicatamente, utilizzando una micropipetta per garantire l'omogeneità di questa soluzione. Registrare lo spettro di fluorescenza.
Ripetere le aggiunte ANS e la registrazione spettrale di fluorescenza come descritto sopra per una relazione molare N-Dominio ANS 1:1. Sottrarre lo spettro vuoto da ogni spettro utilizzando il software. Traccia tutti gli spettri in un singolo grafico Determina se un modello simile a FRET è formato dallo spettro.
Gli spettri di fluorescenza ANS N-Domain formano un modello simile a FRET. Titolazione della florescenza intrinseca N-Domain mediante modifica chimica del triptofano con NBS. Ottenere nuovamente lo spettro di fluorescenza intrinseco del dominio N.
Aggiungere un'aliquota di un microlitro di una soluzione stock NBS millimolare al dominio N sospeso per ottenere una concentrazione finale di un NBS micromolare. Omogeneizzare delicatamente utilizzando una micropipetta per garantire l'omogeneità della soluzione. Registrare lo spettro di fluorescenza.
Ripetere l'addizione NBS e la registrazione spettrale a fluorescenza fino a quando non si osserva una minima tempra intrinseca a fluorescenza N-Domain. Omogeneizzare delicatamente utilizzando una micropipetta per garantire l'omogeneità della soluzione. Sottrarre lo spettro vuoto da ogni spettro utilizzando il software.
Traccia tutti gli spettri in un unico grafico. Titolare il dominio N modificato NBS con ANS registrando spettri di fluorescenza a 25 gradi. Aggiungi ANS e ottieni lo spettro di fluorescenza per eccitazione ad una lunghezza d'onda di 295 nanometri.
Omogeneizzare delicatamente utilizzando una micropipetta per garantire l'omogeneità della soluzione. Registrare lo spettro di fluorescenza. Sottrarre lo spettro vuoto da ogni spettro utilizzando il software.
Traccia tutti gli spettri in un unico grafico. Gli spettri di fluorescenza generati supportano o confutano il verificarsi di FRET. Vale a dire quando si verifica FRET, la fluorescenza ANS non aumenta e viceversa.
Evidenza di legame di ANS al dominio N chimicamente modificato mediante eccitazione a una lunghezza d'onda di 370 nanometri. Aggiungi ANS al dominio N modificato NBS e registra lo spettro di fluorescenza intrinseca del dominio N per eccitazione a una lunghezza d'onda di 370 nanometri. Sottrarre lo spettro vuoto da ogni spettro utilizzando il software.
Traccia tutti gli spettri in un unico grafico. Confermare il legame ANS al dominio N aumentando l'intensità di fluorescenza ANS. Il legame ANS al dominio N mostra un aumento della fluorescenza quando eccitato a una lunghezza d'onda di 370 nanometri.
Panoramica dei risultati. Il complesso Panel A.ANS N-Domain visualizza un modello simile a FRET quando è eccitante a una lunghezza d'onda di 295 nanometri. Il pannello B.NBS spegne la fluorescenza intrinseca del dominio N modificando chimicamente l'unico residuo di triptofano nel dominio N chimicamente modificato.
Pannello C.La fluorescenza ANS aumenta quando viene eccitante a una lunghezza d'onda di 295 nanometri. Pannello D.La fluorescenza ANS aumenta anche quando si emoziona a una lunghezza d'onda di 370 nanometri. Pertanto, l'eccitazione diretta di ANS a una lunghezza d'onda di 295 nanometri è la principale fonte di fluorescenza ANS quando è legata al sito di legame ATP. Conclusioni.
Questi saggi possono essere utilizzati per determinare l'esistenza di FRET tra residui di triptofano e ANS nelle proteine. Il chiarimento del FRET, conferma o meno, tra triptofano e ANS permetterà di trarre conclusioni migliori negli studi strutturali sulle proteine. Il test può anche essere utile quando si utilizzano altri fluorofori.
