Diese Protokolle ermöglichen die Untersuchung der vererbten Immunität gegen Mikrosporidien. Techniken, die hier erklärt werden, können uns helfen zu verstehen, wie Immunität über Generationen hinweg übertragen wird und welche Moleküle die Immunität gegen Mikrosporidien bei Nachkommen bestimmen. C. elegans ist ein einfaches und genetisch handhabbares Modell mit einer kurzen Generationszeit für die Untersuchung der Vererbung.
Die vielen Werkzeuge, die dem Wurm zur Verfügung stehen, können verwendet werden, um molekulare Mechanismen der intergenerationellen Immunität aufzudecken. Verwenden Sie bei der Infektion von P0-Tieren eine niedrige Sporendosis, die die Fähigkeit der Eltern, Nachkommen zu produzieren, nicht wesentlich beeinträchtigt. Dies stellt sicher, dass das Bleichen genügend F1-Tiere für nachgelagerte Experimente liefert Um zunächst die erforderliche Anzahl von 10 Zentimetern unausgesäten Nematoden-Wachstumsmediumplatten von vier Grad Celsius auf Raumtemperatur einen Tag vor geplanten Infektionen zu verschieben.
Kurz vor der Infektion etwa 2.500 synchronisierte L1-Würmer in einem Mikrofugenröhrchen bei 1.400 mal G für 30 Sekunden ablegen. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipettenspitze, um Würmer in 50 Mikrolitern M9-Medien zu belassen. Fügen Sie einen Milliliter 10X Escherichia coli-Stamm OP50 zu den 1-stufigen Würmern und N.parisii-Sporen zur gewünschten Konzentration hinzu.
Als nicht infizierte Kontrolle bereiten Sie ein äquivalentes Röhrchen von L1s und OP50 mit einem Volumen von M9-Medien vor, das dem Volumen der verwendeten Sporenzubereitung entspricht. Mischen Sie die L1-Wurmprobe, indem Sie kurz vorwirbeln und über einen Milliliter Würmer auf eine 10 Zentimeter große, ungesäte Nematoden-Wachstumsmediumplatte streichen. Schwenken, um sicherzustellen, dass sich die Flüssigkeit über die gesamte Platte verteilt.
Trocknen Sie die Platten in einem sauberen Schrank mit abgenommenen Deckeln für 10 bis 20 Minuten oder bis sie vollständig trocken sind, bevor Sie bei 21 Grad Celsius für 72 Stunden inkubieren. 72 Stunden nach der Infektion untersuchen Sie die Platten unter dem Seziermikroskop. Die Platte mit infizierten Würmern sollte weniger Embryonen enthalten als die Platten mit nicht infizierten Würmern.
Dann waschen Sie die Würmer von den Platten in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Milliliter M9-Medium. Wenn viele Würmer auf den Platten verbleiben, pelletieren Sie die Würmer durch Zentrifugation bei 1400 mal G für 30 Sekunden. Entfernen Sie den Überstand und führen Sie zusätzliche Plattenwäschen durch.
Zentrifugieren Sie bei 1400 mal G für 30 Sekunden bei Raumtemperatur, um die Würmer zu pelletieren und waschen Sie zweimal mit einem Milliliter M9-Medien oder bis der Überstand klar ist. Suspendieren Sie es in einem endgültigen Volumen von einem Milliliter M9-Medium und mischen Sie es gut durch Pipettieren. Übertragen Sie 100 Mikroliter der suspendierten Würmer in ein frisches Röhrchen und bleichen Sie die restlichen 900 Mikroliter aus, um die erwachsenen Würmer aufzubrechen und F1-Embryonen zum Testen freizusetzen.
Führen Sie Infektionen mit Modifikationen durch. wie im Manuskript erwähnt. Untersuchen Sie die Platten 72 Stunden nach der Infektion unter einem Seziermikroskop.
Die Platte mit naiven Würmern sollte kleiner sein und weniger Embryonen enthalten als die Platten mit grundierten Würmern. Starten Sie dann den Färbe- und Fixierprozess von Würmern, indem Sie sie von den Platten in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Milliliter 0,1% Tween 20 in M9-Medien waschen. Wenn viele Würmer auf den Platten verbleiben, pelletieren Sie die Würmer durch Zentrifugation bei 1.400 mal G für 30 Sekunden bei Raumtemperatur, entfernen Sie den Überstand mit einer Pipettenspitze und führen Sie zusätzliche Plattenwäschen durch.
Nach dem Pelletieren der Würmer durch Zentrifugieren für 30 Sekunden bei 1.400 mal G bei Raumtemperatur zweimal mit einem Milliliter M9-Medien mit 0,1% Tween 20 waschen oder bis der Überstand klar ist. Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 700 Mikroliter Aceton hinzu und lassen Sie die Würmer bei Raumtemperatur für 10 Minuten fixieren. Pelletieren Sie diese festen Würmer für 30 Sekunden bei 10.000 mal G bei Raumtemperatur und geben Sie zwei Waschungen von einem Milliliter Phosphatpufferkochsalzlösung mit 0,1% Tween 20.
Bereiten Sie 50 Milliliter DY96-Arbeitslösung vor, wickeln Sie den Behälter in Folie und lagern Sie ihn in einer Schublade, um Lichteinwirkung zu vermeiden. 500 Mikroliter DY96-Arbeitslösung in das Schneckenpellet geben und bei Raumtemperatur bei Dunkelheit 30 Minuten drehen. Zentrifugieren Sie diese Reaktion für 30 Sekunden bei 10.000 mal G bei Raumtemperatur, um die Würmer zu pelletieren und den Überstand zu entfernen.
Fügen Sie dann 15 Mikroliter des Montagemediums mit oder ohne DAPI hinzu. Pippen Sie 10 Mikroliter dieser gefärbten Würmer auf einen Objektträger und legen Sie einen Deckscheine darüber. Um die auf Objektträgern montierten DY96-gefärbten Würmer zu analysieren, führen Sie die Bildgebung mit dem GFP-Kanal eines Fluoreszenzmikroskops durch.
Um die Fitness der Wurmpopulationen zu bestimmen, verwenden Sie ein 5X- oder 10X-Ziel, um die Schwerkraft von mehr als 100 Würmern pro Bedingung zu bestimmen. 72 Stunden nach der Infektion wurden die F1-Tiere fixiert und mit DY96 gefärbt, um die Mikrosporidienresistenz zu beurteilen. Infizierte Elternpopulationen und nicht infizierte Kontrollen wurden 72 Stunden nach der Infektion fixiert und mit DY96 gefärbt, um die Wurmembryonen und Mikrosporidiensporen sichtbar zu machen.
Infizierte Tiere sind klein, enthalten viele Mikrosporidiensporen und produzieren weniger Embryonen als gesunde, nicht infizierte Kontrollen. Die Bewertung der Schwerkraft von Würmern zeigte, dass etwa 95% der nicht infizierten Tiere Nachkommen produzierten, verglichen mit den infizierten Tieren, die weniger als 80% betrugen.Quantifizierungen ergaben, dass etwa 90% der mit Mikrosporidien behandelten Population infiziert waren, wie durch die Anzahl der Würmer mit DY96-gefärbten Sporen bestimmt. Quantifizierungen dieser fixierten Tiere ergaben, dass die grundierten Würmer signifikant mehr Embryonen enthielten als ihre naiven Gegenstücke, was auf eine größere Fitness im Angesicht einer Infektion hindeutet.
Fiji ImageJ wurde verwendet, um die Parasitenbelastung einzelner naiver und immungrundierter Würmer zu bestimmen, was der Prozentsatz des Körpers ist, der mit fluoreszierenden N.parisii-Sporen gefüllt ist. Quantifizierungen zeigten eine dramatische Verringerung der Parasitenbelastung von Würmern, die von infizierten Eltern stammten. Darüber hinaus zeigten die Berechnungen der individuellen Wurmgröße, dass grundierte Würmer angesichts der N.parisii-Infektion einen signifikanten Wachstumsvorteil gegenüber naiven Tieren hatten.
Bildgebende Untersuchungen zeigten, dass, während naive Tiere typischerweise mehrere Sporen und mehrere infizierte Zellen enthielten, die grundierten Tiere viel weniger oder keine Sporen und typischerweise keine Sporoplasmen hatten. Wenn unvorbereitete und grundierte F1-Populationen eine ähnliche Anzahl von graviden und infizierten Tieren haben, zählen Sie die Anzahl der Eier pro Tier und analysieren Sie infiziertes Gewebe mit ImageJ, um subtilere Unterschiede zu finden. Während direkte gelbe 96-Flecken reife Sporen bilden, kann die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung Sporoplasmen in Zellen aufdecken.
Dies kann Ihnen die Anzahl der infizierten Zellen in grundierten und nicht vorbereiteten Würmern anzeigen. Diese Techniken haben gezeigt, dass die elterliche transkriptionelle Reaktion bei der Induktion einer vererbten Immunität bei Nachkommen hilfreich sein kann. Forscher untersuchen nun die Art dieser Immunität bei Nachkommen.
